[發明專利]檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，試劑盒與方法

在審

• 申請號: 202111211496.3
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN113699242A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 楊柳;童云廣;蔣佳宏;唐正清;張叔祖;朱虹;任永麗;陳哲靈
• 申請（專利權）人: 浙江省人民醫院;杭州奧明醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 王貞利

本發明公開了檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，試劑盒與方法，包括相應靶標基因的選擇，這里的靶標基因為KRAS及其7種突變型(G12D,G12V,G12C,G12A,G12R,G13D),表觀遺傳相關的為ADAMTS1與BNC1基因的甲基化，三個靶基因的組合，KRAS突變檢測采取的技術為深度測序技術，本發明通過設計與優化三個基因的引物與探針組合；優化PCR相關mix及Tm值，發明了一種聯合使用KRAS，ADAMTS1與BNC1三個基因靶標來檢測者胰腺癌中相應基因突變的試劑盒，本發明對KRAS基因及相關突變，ADAMTS1與BNC1的甲基化特異性高，靈敏度好，價格低廉，非常適合篩查胰腺癌高危人群的基因突變，因此有高的社會效率與經濟效率。

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，更具體地，涉及一種檢測靈敏度高，節省樣本量與試劑盒成本，提高成功率的檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，試劑盒與方法。

背景技術

胰腺導管腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，其總體5年生存率約為5％。只有15-20％的患者接受手術切除；由于胰腺特殊的結構特征和疾病早期的非典型性癥狀，另外80％-85％的患者在診斷時，已經發展成轉移性或局部晚期胰腺癌，在影像學檢查中偶然診斷為非相關疾病的胰腺癌患者比有癥狀的患者有更長的中位生存時間，這些數據表明，早期發現癌癥是改善這種侵襲性疾病預后的關鍵問題。Yachida等人報道了從胰腺開始突變到轉移性胰腺癌發展的時間大約是21年，這為胰腺癌的早期發現提供了一個廣闊的窗口。既往研究證實了早期檢測對胰腺癌患者預后的關鍵作用。篩查高危人群，識別胰腺癌前病變，發現新的生物標志物，可以幫助醫生在早期識別患者，從而極大改善胰腺癌的5年生存率。

在胰腺癌中，原癌基因KRAS的突變是在前驅病變和大多數腫瘤中發現的早期驅動突變，根據《癌癥體細胞突變目錄》(COSMIC)數據庫，截至2016年1月，KRAS突變在所有組織學亞型數據庫中的患病率為57％，胰腺癌中，KRAS 12號染色體上的GGT密碼子突變最為突出，G12D占29％，G12V占18％，G12C占2％，在其他癌種中還有G12A，G12R與13號染色體上G13D的突變。在腺癌患者中，KRAS突變的患病率(65％)明顯高于神經內分泌腫瘤患者(2％)。在慢性良性胰腺炎中KRAS突變發生率為18％，這可能已經是胰腺癌的前兆病變，所以KRAS可以作為胰腺癌腫瘤的早診的標志物之一。

胰腺癌的特征是多重遺傳和表觀遺傳的改變。近年來的研究表明，胰腺癌既是一種DNA突變的疾病，也是一種表觀遺傳學失調的疾病。特別是，DNA啟動子甲基化模式的改變可能在腫瘤發生和癌癥進展中發揮關鍵作用。為了解決臨床診斷和治療的需要，許多研究已經使用DNA甲基化分析的特定基因，在多種癌癥診斷中應用。原則上，這種診斷測試可用于早期檢測、評估預后、作為治療反應的預測因子和治療靶點。早期發現疾病可以改善大多數癌癥的臨床結果。最近，已有多個成功的DNA甲基化篩查的報道，使用不同的體液，如糞便檢測結直腸癌和，痰檢測肺癌，尿液檢測前列腺癌。然而，目前沒有篩查工具可以用于胰腺癌的早期檢測。

隨著表觀遺傳變化在胰腺癌中作用的研究和已經公開發表文獻的研究，表明胰腺癌中普遍存在甲基化的變化。在綜合閱讀大量文獻后，發明人選擇了兩種生物標志物ADAMTS1(一種具有血栓反應蛋白基型的解整合素和金屬蛋白酶1)和BNC1(鋅指蛋白basonuclin-1)作為血液中胰腺癌早期檢測的高度敏感標志物，在先前對選定的胰腺癌患者的研究中，有報道稱，這兩種基因在非侵入性液體中的靈敏度和特異性分別為81％和85％。

發明內容

針對目前市場上未出現專用于檢測胰腺癌早期基因突變的方法與產品，本發明提供了一種檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，試劑盒與方法。