[發明專利]檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，試劑盒與方法

在審

• 申請號: 202111211496.3
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN113699242A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 楊柳;童云廣;蔣佳宏;唐正清;張叔祖;朱虹;任永麗;陳哲靈
• 申請（專利權）人: 浙江省人民醫院;杭州奧明醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 王貞利

1.一種用于早期檢測胰腺癌的多聯合基因靶點，其特征在于，包括KRAS基因的第2號外顯子的第12和13密碼子的7種突變型，ADAMTS1的甲基化與BNC1的甲基化。

2.根據權利要求1所述的一種用于早期檢測胰腺癌的多聯合基因靶點，其特征在于，所述KRAS基因的第2號外顯子的第12和13密碼子的7種突變型包括Gly12Ser，Gly12Aeg，Gly12Cys，Gly12Asp，Gly12Ala，Gly12Val與Gly13Asp。

3.檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，其特征在于，所述引物探針包括針對檢測權利要求1-2任一項所述的7種KRAS基因突變型的捕獲探針組A，檢測ADAMTS1甲基化的引物探針組B，檢測BNC1甲基化的引物探針組C與檢測ATCB基因的引物探針組D；

所述引物探針組B包括正向引物b，反向引物b和探針b；

所述引物探針組C包括正向引物c，反向引物c和探針c；

所述引物探針組D包括正向引物d，反向引物d和探針d；

所述探針b，探針c和探針d的5’端設有報告熒光基團，所述探針b，探針c和探針d的3’端設有淬滅熒光基團。

4.根據權利要求3所述的檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，其特征在于，所述正向引物b的核苷酸序列為SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5；所述反向引物b的核苷酸序列為SEQ ID No.2，SEQ ID No.4或SEQ ID No.6；所述探針b的核苷酸序列為SEQ ID No.13。

5.根據權利要求3所述的檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，其特征在于，所述正向引物c的核苷酸序列為SEQ ID No.7，SEQ ID No.9或SEQ ID No.11；所述反向引物c的核苷酸序列為SEQ ID No.8，SEQ ID No.10或SEQ ID No.12；所述探針c的核苷酸序列為SEQ ID No.14。

6.根據權利要求3所述的檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，其特征在于，所述正向引物d的核苷酸序列為SEQ ID No.19；所述反向引物d的核苷酸序列為SEQID No.20；所述探針d的核苷酸序列為SEQ ID No.15。

7.根據權利要求4或5或6所述的檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，其特征在于，報告熒光基團包括FAM，HEX，VIC，TET，CY3，CY5或ROX，淬滅熒光基團為BHQ1。

8.根據權利要求3所述的檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的引物探針，其特征在于，捕獲探針組A為SEQ ID No.16與SEQ ID No.17。

9.一種檢測KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的試劑盒，其特征在于，包括權利要求3-8任一項所述的引物探針。

10.一種KRAS基因突變、ADAMTS1與BNC1甲基化的檢測方法，其特征在于，包括使用權利要求3-8任一項所述的引物探針或包括權利要求9所述的試劑盒；所述檢測方法包括以下步驟：

1)提取生物樣本中的游離DNA；

2)對步驟1)得到的部分游離DNA進行甲基化轉化并純化；

3)將步驟2)甲基化轉化并純化后的游離DNA與剩余未轉化的游離DNA進行熒光定量PCR擴增，并得到結果；

其中，PCR的每個體系50μL，其中含1xPCR反應緩沖液、200-400μm dNTPs、2-7mM MgCl₂與1-5U AmpliTaq DNA聚合酶；

ADAMTS1與BNC1基因區域靶點的正向引物與反向引物各250-550nM，ADAMTS1與BNC1基因區域靶點的探針各200-400nM，ACTB基因區域靶點的正向引物與反向引物150-300nM，ACTB基因區域靶點的探針50-150nM。