[發明專利]高活性的mTET2酶突變體、其編碼DNA及其應用

有效

• 申請號: 202111208754.2
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN113846070B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 侯策;韋磊;江翱;陳晶晶;黃開喻;滕以剛;曹振;宋東亮
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12Q1/6886
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發明提供了高活性的mTET2酶突變體，mTET2CDT和mTET2CDTm。mTET2CDT是在野生型mTET2氨基酸序列(Uniprot：Q4JK59?1)中，只保留1042?1347和1747?1848兩個結構域的氨基酸序列，中間用GGGGS來進行連接得到的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示，編碼DNA序列如SEQ?ID?No.1所示。mTET2CDTm在mTET2CDT的基礎上進行了V1307L和V1309C點突變，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示，編碼DNA序列如SEQ?ID?No.2所示。mTET2CDT和mTET2CDTm顯著提高了mTET2的氧化活性。此外，mTET2CDTm還提高了氧化5mC過程中5hmC中間產物的占比。這兩個高活性的TET酶突變體有效提高了DNA甲基化檢測的靈敏度和準確性，可以應用于疾病診斷，尤其是在腫瘤早篩領域。

技術領域

本發明專利涉及高活性的mTET2酶突變體mTET2CDT和mTET2CDTm、其編碼DNA及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA中最常見的堿基修飾方式，約占所有胞嘧啶的1%-8%，被稱為“第五種堿基”。DNA甲基化與染色質狀態和基因轉錄活躍程度具有明顯的相關性，是預測基因表達水平的有效依據。因此，DNA甲基化水平檢測是臨床疾病診斷的有效手段?，F有的DNA甲基化檢測技術主要是依賴于反向篩選的重亞硫酸鹽轉化法，其原理是利用重亞硫酸鹽將未甲基化的胞嘧啶轉變成尿嘧啶，再通過PCR擴增轉變成胸腺嘧啶。這種方法具有DNA損傷大、背景噪音高和準確性低等缺陷。近年來，酶轉化法甲基化檢測技術因為具備DNA損傷小、背景噪音低、準確性高和數據質量好等優點而成為DNA甲基化檢測領域的重要關注點。

DNA羥甲基化酶TET是真核生物中普遍存在的一種α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依賴的雙加氧酶，在生物進化過程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化過程的關鍵蛋白，可以將5mC通過三步氧化反應（5mC-5hmC-5fC-5caC）轉變成5caC。目前的酶轉化法DNA胞嘧啶甲基化檢測技術都是依賴于TET酶催化甲基化胞嘧啶的能力，TET蛋白是酶轉化法DNA甲基化檢測技術的核心蛋白，具有極大的工程改造和應用價值。

發明內容

本發明提供了兩種高活性的mTET2酶突變體mTET2CDT和mTET2CDTm。mTET2CDT是在野生型mTET2氨基酸序列(Uniprot：Q4JK59-1)中，只保留1042-1347和1747-1848兩個結構域的氨基酸序列，中間用GGGGS來進行連接得到的融合蛋白，其序列如SEQ?ID?No.3所示，編碼DNA序列如SEQ?ID?No.1所示。mTET2CDTm在mTET2CDT的基礎上進行了V1307L和V1309C點突變，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示，編碼DNA序列如SEQ?ID?No.2所示。mTET2CDT和mTET2CDTm顯著提高了mTET2的氧化活性。此外，mTET2CDTm還提高了氧化5mC過程中5hmC中間產物的占比。這兩個高活性的TET酶突變體有效地DNA甲基化檢測靈敏度和準確性，可以應用于疾病診斷，尤其是在腫瘤早篩領域。

優選的，我們公布了mTET2CDT和mTET2CDTm在DNA甲基化檢測中的應用，其步驟包括：

（1）在待測樣本中加入所述的TET酶突變體進行氧化反應，將樣本中的5mC氧化成5hmC；

（2）終止反應，回收DNA；

（3）DNA甲基化檢測分析。

優選的，所述應用步驟（1）中還加入TET酶氧化緩沖液。

更為優選的，所述TET酶氧化緩沖液配比為：