[發明專利]應用于紅細胞超分辨成像及單分子追蹤的綜合分析方法

在審

• 申請號: 202111207994.0
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN113945549A
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 楊薇;葉智偉;肖義
• 申請（專利權）人: 國科溫州研究院（溫州生物材料與工程研究所）;大連理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司 21208
• 代理人: 楊翠翠

應用于紅細胞超分辨成像及單分子追蹤的綜合分析方法，其屬于活細胞超分辨成像及分析的技術領域。該方法利用微流控芯片對表面光滑的人類紅細胞進行無創捕獲，利用流體控制精準模擬生理微環境，結合先進的超分辨成像技術以及單分子追蹤分析，在高時空精確度下，實現單個活細胞的超微結構成像及其膜表面動態分析。在單分子水平上，該方法提供精確、動態、多維度、高分辨率、單分子水平的生物成像表征，定量揭示人類紅細胞變化的生物學機制，可適用于大規模的探究紅細胞在刺激物作用下的響應規律，并為疾病提供早期預警信息。

技術領域

本發明涉及應用于紅細胞超分辨成像及單分子追蹤的綜合分析方法，其屬于活細胞超分辨成像及分析的技術領域。

背景技術

紅細胞是人體血液中數量最多的一種細胞，承擔運送氧氣和二氧化碳的重要作用。傳統的紅細胞評價方法僅僅停留在對細胞群體平均值的評估，而且由于光學衍射極限的存在，無法對200nm以下的超微結構進行觀測和動態分析，缺乏從分子層面上對紅細胞的生理功能及狀態可視定量化評價手段。一直以來，生物學家都企盼在不影響活細胞的固有屬性前提下，在結構及分子層面實現活細胞的超高分辨率成像。近年來發展的超分辨熒光顯微成像技術不僅實現納米尺度分辨成像，而且保留了光學顯微鏡在生物成像方面的獨有優勢，比如活體、高速、低損傷、長時程、特異性熒光標記等等。利用超分辨成像，可以成功的實現活細胞的檢測，并且突破常規光學衍射極限的限制，以更加直觀、深入的方式認知復雜生命現象本質。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供應用于紅細胞超分辨成像及單分子追蹤的綜合分析方法，將納米尺度的超微結構信息和單分子尺度的瞬時動態信號共同作為紅細胞生理狀態的評判參考，這兩種參數刻畫了多種復雜生物分子復合體的時空分布及代謝機制。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案：應用于紅細胞超分辨成像及單分子追蹤的綜合分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、樣品的制備

采指尖血，加入等比例抗凝血劑及適宜濃度的細胞膜熒光染料染色，待染色完畢后，使用等滲溶液洗去多余染料，得到熒光染料標記的血紅細胞樣品。

S2、紅細胞的固定

將熒光染色后的血紅細胞樣品注入到高通量微流控芯片中，芯片中紅細胞固定腔室的高度不超過紅細胞線度的一倍，紅細胞被吸入紅細胞固定腔室后被單層固定；

S3、基于單分子定位的超分辨成像

載有紅細胞的微流控芯片置于超分辨顯微鏡上進行成像觀察，高密度單分子信號疊加后得到紅細胞的超分辨重構圖；

S4、單分子追蹤分析

低密度單分子信號疊加后進行單顆粒的追蹤分析；

在超分辨成像中通過點擴散函數PSF獲得的單分子定位信息，得到細胞的定位坐標可以直接應用于單分子追蹤分析；

r²是單分子在Δt時間內運動的平方位移，計算如下：

r²(t,Δt)＝(x_t-x_t+Δt)²+(y_t-y_t+Δt)² (1)

其中：Δt是成像拍攝的曝光時間，t為該分子定位的時刻，x_t為t時刻的該分子的x坐標值，x_t+Δt為為t+ Δt時刻的該分子的x坐標值；y_t為t時刻的該分子的y坐標值，y_t+Δt為為t+Δt時刻的該分子的y坐標值；

細胞膜表面單個分子的均方位移MSD，計算如下：