[發明專利]蛆激酶制備方法及其用途

有效

• 申請號: 202111197876.6
• 申請日: 2021-10-14
• 公開（公告）號: CN113755476B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 劉燦;劉秋荻;馬彤瑤;馬蘭青;榮龍;張凱欣;戴隆海;雷夢;孫祎振;郭蓓;孫媛霞
• 申請（專利權）人: 北京農學院;劉燦
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;A61K38/48;A61P7/02;A61P9/10;A61P9/14
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 喬獻麗

本發明提供蛆激酶的制備方法，所述方法包括蠅蛆的預處理、鹽析、透析或超濾、離子交換層析柱層析、洗脫，以獲得蛆激酶粗制品。所述方法還包括采用含有絲氨酸蛋白吸附配體的填料進行親和層析、洗脫，從而獲得蛆激酶精制品。本發明獲得的蛆激酶具有將纖維蛋白及纖維蛋白原降解的高活力，為溶栓藥物的開發和利用提供了堅實的基礎。

技術領域

本發明屬于生物化學制藥技術領域，具體涉及從蠅蛆中提取高活性蛆激酶的方法。

背景技術

正常情況下，身體內止血調節機制與抗凝機制相互拮抗，當機體調節機制發生病變時，過量的凝血酶生成，使纖維蛋白沉積，從而引發體內血栓形成。血栓作為常見的心腦血管病，會誘發心肌梗死、缺血性腦梗死、冠狀動脈硬化性心臟病等癥狀，嚴重威脅人們身體健康，每年死于腦梗塞、腦溢血、心肌梗死的病人達數百萬。

目前常用的抗血栓藥物主要分為3類：一是抗血小板類藥物；二是抗凝血藥物如肝素、維生素K拮抗劑等；三是溶血栓藥物。溶栓藥物具有溶解血栓速度快，且副作用小的優勢，成為血栓類疾病治療的重要手段。溶栓酶可以通過以下途徑發揮溶栓作用：1、降低纖維蛋白原含量，抑制纖維蛋白原生成纖維蛋白；2、直接水解纖維蛋白原和纖維蛋白(溶酶)；3、激活纖溶系統，促進纖溶酶原轉化為纖溶酶，促進血管內皮細胞產生組織纖溶酶原激活劑(t-PA)，抑制纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)生成，增強內源纖溶活力(激酶)。自然界資源是獲取溶栓藥物的天然寶庫，目前溶栓酶的來源較為廣泛，微生物、植物、動物中可分離得到具有溶血栓活性的物質。常見的納豆激酶，是在納豆發酵過程中由納豆枯草桿菌產生的一種絲氨酸蛋白酶，具有降解血栓、軟化血管的功能；從健康人尿中分離的尿激酶，不僅能降解纖維蛋白凝塊，亦能降解血循環中的纖維蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等；以及臨床廣泛使用的蚓激酶，也具有溶栓作用，可用于冠心病心絞痛、腦梗塞的治療。研究報道水蛭、蝙蝠、蛇毒中也可作為溶栓酶提取的原料。

但利用納豆生產的納豆激酶由于野生型納豆芽孢桿菌的納豆激酶含量不高，由此得到的納豆激酶的生產方法亦不夠理想；尿激酶由于收集尿液、儲運、消臭等程序，對環境衛生造成不良的后果，影響周邊居民的生活；蚓激酶則需要從特殊種類的蚯蚓中提取。

因此，仍然需要尋找新的溶栓酶提取來源，以能夠高產量地提取高活性的溶栓酶。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供以下技術方案：

一方面，本發明提供蛆激酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a.將原料洗凈，加入勻漿劑后進行勻漿；

b.對勻漿液進行離心，收集上清液A；

c.在上清液A中加入硫酸銨飽和度達到25％-35％，靜置，析出蛋白沉淀，離心，收集上清液B；

d.在上清液B中補充硫酸銨至65％-75％飽和度，靜置，離心，棄上清，收集沉淀；

e.沉淀用溶劑溶解，得到溶液C；

f.對溶液C進行透析或超濾，除去溶液C中鹽離子，至電導率低于200μs/cm，得到溶液D；

g.調節溶液D為pH?4-8，得到溶液E；

h.溶液E用濾膜過濾，進行層析，目標蛋白吸附在離子交換層析柱上；

i.用洗脫液洗脫層析柱，收集有活性的洗脫峰溶液F；

j.對溶液F進行透析或超濾，除去溶液F中鹽離子，得到溶液G；

k.溶液G濃縮，冷凍干燥，得到蛆激酶粗品；

l.蛆激酶的精制：將步驟j獲得的溶液G平衡至pH6.5-8，利用含有絲氨酸蛋白酶吸附配體的填料對溶液G中蛆激酶進行親和吸附，利用洗脫液洗脫，獲得有活性的洗脫液H；