[發明專利]蛆激酶制備方法及其用途

有效

• 申請號: 202111197876.6
• 申請日: 2021-10-14
• 公開（公告）號: CN113755476B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 劉燦;劉秋荻;馬彤瑤;馬蘭青;榮龍;張凱欣;戴隆海;雷夢;孫祎振;郭蓓;孫媛霞
• 申請（專利權）人: 北京農學院;劉燦
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;A61K38/48;A61P7/02;A61P9/10;A61P9/14
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 喬獻麗

1.蛆激酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a.?原料蠅蛆洗凈，加入勻漿劑后進行勻漿；

b.?對勻漿液進行離心，收集上清液A；

c.?在上清液A中加入硫酸銨飽和度達到25%-35%，靜置，析出蛋白沉淀，離心，收集上清液B；

d.?在上清液B中補充硫酸銨至65%-75%飽和度，靜置，離心，棄上清，收集沉淀；

e.?沉淀用蒸餾水溶解，得到溶液C；

f.?對溶液C進行透析或超濾，除去溶液C中鹽離子，至電導率小于?200μs/cm，得到溶液D；

g.?調節溶液D為pH?4-8，得到溶液E；

h.?溶液E用濾膜過濾，進行層析，目標蛋白吸附在離子交換層析柱上，所述層析柱為CM-52；

i.?用洗脫液洗脫層析柱，收集有活性的洗脫峰溶液F；

j.?對溶液F進行透析或超濾，除去溶液F中鹽離子，得到溶液G；

k.?溶液G濃縮，冷凍干燥，得到蛆激酶粗品。

2.蛆激酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a.?原料蠅蛆洗凈，加入勻漿劑后進行勻漿；

b.?對勻漿液進行離心，收集上清液A；

c.?在上清液A中加入硫酸銨飽和度達到25%-35%，靜置，析出蛋白沉淀，離心，收集上清液B；

d.?在上清液B中補充硫酸銨至65%-75%飽和度，靜置，離心，棄上清，收集沉淀；

e.?沉淀用蒸餾水溶解，得到溶液C；

f.?對溶液C進行透析或超濾，除去溶液C中鹽離子，至電導率小于?200μs/cm，得到溶液D；

g.?調節溶液D為pH?4-8，得到溶液E；

h.?溶液E用濾膜過濾，進行層析，目標蛋白吸附在離子交換層析柱上，所述層析柱為CM-52；

i.?用洗脫液洗脫層析柱，收集有活性的洗脫峰溶液F；

j.?對溶液F進行透析或超濾，除去溶液F中鹽離子，得到溶液G；

l.?蛆激酶的精制：將步驟j獲得的溶液G平衡至pH6.5-8，利用含有絲氨酸蛋白酶吸附配體的填料對溶液G中蛆激酶進行親和吸附，利用洗脫液洗脫，獲得有活性的洗脫液H，親和層析填料接枝有選自以下任意一種的配體：苯甲脒、對氨基苯脒鹽酸鹽、大豆胰蛋白酶抑制劑和卵黏蛋白；

m:?對溶液H進行透析或超濾，除去溶液H中鹽離子，得到溶液I；

n：將溶液I濃縮，冷凍干燥，得到蛆激酶精制品。

3.根據權利要求1或2所述的蛆激酶的制備方法，步驟a中所述原料選自家蠅屬幼蟲、麗蠅科幼蟲、廁蠅屬幼蟲；勻漿劑選自蒸餾水和PBS緩沖液。

4.根據權利要求3所述的蛆激酶的制備方法，其中所述家蠅屬選自家蠅和市蠅。

5.根據權利要求3所述的蛆激酶的制備方法，其中所述麗蠅科選自金蠅屬大頭金蠅和綠蠅屬絲光綠蠅。

6.根據權利要求3所述的蛆激酶的制備方法，其中所述廁蠅屬選自夏廁蠅和元廁蠅。

7.根據權利要求1-2中任一項所述的蛆激酶的制備方法，步驟g中，采用檸檬酸緩沖液或PBS緩沖液調節pH。

8.根據權利要求1-2中任一項所述的蛆激酶的制備方法，步驟i中，所述洗脫液選自NaCl+PBS、KCl+PBS。

9.根據權利要求2所述的蛆激酶的制備方法，步驟k、n中，溶液G的濃縮方法包括利用超濾裝置截留2000-50000分子量的物質，進行濃縮，或利用分子量大于12000的PEG進行濃縮。

10.蛆激酶，其根據權利要求1-9中任一項所述的方法制備。

11.根據權利要求1-9中任一項所述的方法制備的蛆激酶在制備溶栓藥物、抗栓藥物中的用途。