[發(fā)明專利]厚壁菌門與擬桿菌門的核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111193305.5
• 申請(qǐng)日: 2021-10-13
• 公開（公告）號(hào): CN113981114A
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方鵬宇;郭紅輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東君道營養(yǎng)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 孫鳳俠

1.一種厚壁菌門與擬桿菌門的檢測(cè)引物組，其特征在于，包含檢測(cè)厚壁菌門與擬桿菌門的多重qPCR引物和探針，檢測(cè)厚壁菌門的上游引物、下游引物和探針分別為Fir-F1、Fir-R1和Fir-P1，其序列依次如SEQ ID NO.1～3所示；檢測(cè)擬桿菌門的上游引物、下游引物和探針分別為Bac-F1、Bac-R1和Bac-P1，其序列依次如SEQ ID NO.16～18所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)引物組，其特征在于，所述厚壁菌門探針的5’端熒光發(fā)射基團(tuán)為FAM，3’端淬滅基團(tuán)為BHQ1；擬桿菌門探針的5’端熒光發(fā)射基團(tuán)為TEXAS RED，3’端淬滅基團(tuán)為BHQ2。

3.權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)引物組在制備同時(shí)檢測(cè)腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門試劑中的應(yīng)用。

4.一種同時(shí)檢測(cè)厚壁菌門和擬桿菌門的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)引物組。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，還含有熒光PCR反應(yīng)所需試劑：5×DNA PCRBuffer，酶系，dd H₂O。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包含以下步驟：

S1.提取待測(cè)糞便樣本中的核酸作為模板；

S2.取S1步驟中的模板，利用權(quán)利要求1所述檢測(cè)引物組進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；

S3.分析S2步驟的反應(yīng)結(jié)果。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，步驟S2中的熒光定量PCR反應(yīng)體系為：待檢測(cè)核酸樣本5μL，5×DNA PCR Buffer 5μL，上游引物0.1μL，下游引物0.1μL，探針0.1μL，酶系3μL，ddH₂O 6.4μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，步驟S2中的熒光定量PCR反應(yīng)體系中上游引物、下游引物和探針的終濃度為10pmol。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，步驟S2中的熒光定量PCR反應(yīng)條件為：50℃，2min，1個(gè)循環(huán)；95℃，5min，1個(gè)循環(huán)；95℃，5sec，60℃，20sec，45個(gè)循環(huán)。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，步驟S3中的結(jié)果判斷方法如下：

陽性檢測(cè)結(jié)果的判斷依據(jù)為：對(duì)應(yīng)熒光通道內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且Ct值≤38；

通過分別讀取厚壁菌門Fir和擬桿菌門Bac菌的Ct值，計(jì)算所測(cè)樣本中厚壁菌門與擬桿菌門的菌群比值，F(xiàn)ir/Bac菌群比值越大代表肥胖程度越高，F(xiàn)ir/Bac菌群比值越小代表存在2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)越高。