[發明專利]一種幾丁質酶和AfChi18基因及其表達方法與應用

有效

• 申請號: 202111192540.0
• 申請日: 2021-10-13
• 公開（公告）號: CN113717963B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 楊登峰;伍雅勵;潘麗霞;陽麗艷;李紅亮
• 申請（專利權）人: 廣西華仁醫學科技集團有限公司;廣西科學院
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/00;C12P19/04;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 韓迎之

本發明提供了一種幾丁質酶、AfChi18基因及其表達方法與應用，屬于基因工程技術領域。本發明提供的幾丁質酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，編碼所述幾丁質酶的AfChi18基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，本發明還提供了包含AfChi18基因的重組質粒以及用于表達所述重組質粒的重組菌株。本發明提供的幾丁質酶為典型的幾丁質內切酶，大小為40KDa，該幾丁質酶的最適反應溫度為45℃，在20℃～50℃范圍內熱穩定性好；最適pH為5.0，在pH4.0～6.0具有較高的酶活，表明本發明提供的幾丁質酶具有較高的穩定性。

技術領域

本發明涉及基因工程的技術領域，尤其涉及一種幾丁質酶和AfChi18基因及其表達方法與應用。

背景技術

幾丁質又稱殼多糖(chitin)，分子式為[C₈H₁₃O₅N]_n。為N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-D-glcnac-glucosamine)通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的結構同多糖，廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的甲殼和真菌的胞壁中，蝦殼中的幾丁質含量為25％左右，從蝦殼中提取甲殼素的成本低、產量高。幾丁質作為一種重要的生物資源，在地球上含量僅次于纖維素，年自然生產量為10¹¹噸，是一種巨大的可再生資源。近些年來，幾丁質的綠色應用已經成為科研熱點。

幾丁質的降解產物是高附加值的幾丁質寡糖、幾丁質單糖及其對應衍生物等，具有抗微生物、抗氧化、基因治療、免疫細胞增殖和腫瘤生長抑制的作用，作為添加劑被廣泛應用于飼料和食品中。幾丁質寡糖在現階段的制備方法有化學提取法，殼寡糖乙酰化法。化學提取法一般使用的是酸水解法，利用強酸降解幾丁質為氨基葡萄糖，經乙酰化后獲得N-乙酰氨基葡萄糖；或用稀酸直接降解幾丁質生成幾丁質寡糖。化學提取法反應劇烈，成本高，而且環境污染嚴重，幾丁質寡糖產物聚合度低。為了迎合國家綠色可持續發展政策，生物酶法綠色降解幾丁質現已成為科研熱點。生物酶法降解幾丁質制備幾丁質寡糖，具有反應過程溫和，生物活性好以及高效利用廢棄物甲殼資源的優點。

幾丁質酶按照糖苷鍵的切割方式可分為內切幾丁質酶、外切幾丁質酶及N-乙酰葡萄糖苷酶。內切幾丁質酶可隨機作用于幾丁質長鏈的任何一個糖苷鍵，并將它水解成幾丁質寡糖。外切幾丁質酶與內切幾丁質酶不同，其可從幾丁質糖鏈非還原末端將幾丁質降解為(GlcNAc)₂。然而N-乙酰葡萄糖苷酶不能直接作用于幾丁質，只能將幾丁質寡糖水解生成GlcNAc。幾丁質酶將廢棄物幾丁質降解生成幾丁質寡糖，反應條件溫和，綠色環保及其原料低成本和高產出，完全符合工業生產要求。

因此，挖掘具有高酶活的新型幾丁質酶和高效利用生物質多糖具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種幾丁質酶和AfChi18基因及其表達方法與應用。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種幾丁質酶，所述幾丁質酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

本發明還提供了一種編碼所述幾丁質酶的AfChi18基因，所述AfChi18基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明還提供了一種重組質粒，所述重組質粒包括編碼所述幾丁質酶的AfChi18基因的核苷酸序列。

本發明還提供了一種重組菌株，所述重組菌株表達所述的重組質粒。

本發明還提供了一種所述幾丁質酶的表達方法，包括如下步驟：

(1)將AfChi18基因與質粒載體連接，得到重組質粒；

(2)將所述重組質粒轉化至克隆菌株，得到重組克隆菌株；

(3)提取所述重組克隆菌株中的質粒，轉化至表達菌株，得到重組表達菌株；