[發(fā)明專利]檢測蓋塔病毒的熒光RT-RAA引物、試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111191385.0
• 申請日: 2021-10-13
• 公開（公告）號: CN114015805A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐志文;周遠成;朱玲;聶民財;鄺山
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué);畜科生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

本發(fā)明公開了檢測蓋塔病毒的熒光RT?RAA引物、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明所保護的基于熒光RT?RAA的檢測蓋塔病毒的試劑盒包括檢測蓋塔病毒的組合物即序列表中序列2所示的引物RT?RAA?F2、序列表中序列3所示的引物RT?RAA?R2和序列表中序列4所示探針。實驗證明，該試劑盒能夠快速高效的檢測GETV，在39℃恒溫反應(yīng)30min即可完成檢測，靈敏度為8拷貝/反應(yīng)的GETV SC201807病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄本和20TCID50/反應(yīng)的GETV SC201807病毒RNA，特異性好，準確性高，可以為豬蓋塔病毒的臨床樣品的檢測提供技術(shù)支撐。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測蓋塔病毒的熒光RT-RAA引物、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蓋塔病毒(Getah virus,GETV)是披膜病毒科甲病毒屬的人畜共患病病毒，正鏈RNA病毒。主要引起豬發(fā)生發(fā)燒、腹瀉和繁殖障礙，導(dǎo)致馬出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹和水腫等臨床癥狀。在過去幾年中，研究人員先后在野豬、藍狐、牛等動物中分離到蓋塔病毒，并且通過血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雞和鴨血清內(nèi)含有GETV特異性抗體，說明雞和鴨也可能是蓋塔病毒的感染宿主。

為了便于臨床診斷和流行病學(xué)研究，需要建立一種快速有效的蓋塔病毒檢測方法。目前已經(jīng)建立了多種方法用于GETV的臨床檢測，包括病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗、血清中和試驗、RT-PCR和RT-qPCR等。病毒分離費時費力，血清學(xué)檢測易與其他甲病毒屬成員出現(xiàn)交叉反應(yīng)，其他方法操作復(fù)雜并且需要昂貴的儀器。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何快速檢測蓋塔病毒或如何制備檢測蓋塔病毒的RT-RAA試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了基于熒光RT-RAA用于檢測蓋塔病毒的試劑盒。所述試劑盒可包括檢測蓋塔病毒的組合物。所述組合物可包括引物RT-RAA-F2、RT-RAA-R2和探針。所述引物RT-RAA-F2的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述引物RT-RAA-R2的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述探針的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

上文所述試劑盒可為基于熒光RT-RAA技術(shù)的試劑盒。

上文所述試劑盒中，所述探針可具有下述任一修飾或其組合：

A1)在序列表中序列4第31核苷酸上標記熒光基團；

A2)在序列表中序列4的第32位核苷酸標記淬滅基團；

A3)在序列表中序列4的第31位堿基和32位堿基中間用四氫呋喃修飾；

A4)在序列表中序列4的第46位核苷酸用C3-spacer標記。

上文所述熒光基團可為I6FAM。所述四氫呋喃修飾基團可為dSpacer(IDSP)。所述淬滅基團可為IBHQ1。

上文所述試劑盒中，所述組合物還可包括RT熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元。所述RT熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元可包含單鏈DNA結(jié)合蛋白、重組酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和/或DNA聚合酶。所述RT熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元可來源于熒光型RT-RAA核酸擴增試劑盒。所述RT熒光基礎(chǔ)反應(yīng)單元可為凍干粉。

上文所述試劑盒中，所述組合物還包括鎂離子緩沖液。所述鎂離子緩沖液可為醋酸鎂(濃度280mmol/L)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了上文所述的檢測蓋塔病毒的組合物。

上文所述組合物的各組分可為液體和/或固體粉末。

上文所述組合物的各組分可為單獨包裝。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于檢測蓋塔病毒的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可含有上文所述的試劑盒和熒光檢測儀器。

上文所述系統(tǒng)可為基于熒光RT-RAA技術(shù)的系統(tǒng)。所述熒光檢測儀器可為熒光定量PCR儀。