[發(fā)明專利]一種可誘導(dǎo)B細(xì)胞缺陷小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111189601.8
• 申請日: 2021-10-13
• 公開（公告）號: CN113615643B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫瑞林;王津津;池駿
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東南模生物科技有限公司;上海南方模式生物科技股份有限公司;上海砥石生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;A01K67/027;C12N15/62
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

本發(fā)明提供一種可誘導(dǎo)B細(xì)胞缺陷小鼠模型的構(gòu)建方法及其在B細(xì)胞缺陷藥物中的應(yīng)用。該方法將白喉毒素受體和綠色熒光蛋白定點插入到Cd19分子基因表達(dá)框，構(gòu)建了一個Cd19?IRES?DTR?EGFP（簡稱：Cd19?DTR）基因修飾小鼠模型，該模型可以實現(xiàn)小鼠內(nèi)源Cd19基因驅(qū)動白喉毒素受體和綠色熒光蛋白表達(dá)。利用該模型，可以通過在特定時間點或時間段內(nèi)給予小鼠白喉毒素將B細(xì)胞殺死，造成B細(xì)胞缺陷，對B細(xì)胞在特定生理、病理過程中的作用進(jìn)行研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可誘導(dǎo)B細(xì)胞缺陷小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

B細(xì)胞，又稱B淋巴細(xì)胞，來一種源于骨髓的多能干細(xì)胞。B細(xì)胞在抗原刺激下可分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞可合成和分泌抗體（免疫球蛋白），產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答；同時，活化的B細(xì)胞還是一類抗原遞呈細(xì)胞其表面BCR結(jié)合可溶性抗原，通過內(nèi)吞和加工后，以抗原肽：MHC-Ⅱ類分子復(fù)合物形式提呈給CD4⁺ T細(xì)胞。除此之外，激活的B細(xì)胞還可以產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及造血。近年來，在腫瘤免疫治療的研究中發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，B細(xì)胞對抗腫瘤免疫產(chǎn)生起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用，B細(xì)胞浸潤和免疫治療的效果呈正相關(guān)。

在體內(nèi)特異性的剔除某一類細(xì)胞，是研究細(xì)胞在體內(nèi)功能的一種有效方法。為了更好的研究B細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要作用，研究人員開發(fā)了多種B細(xì)胞缺陷小鼠模型，如Jh小鼠模型，該模型通過敲除小鼠抗體重鏈基因的J位點，導(dǎo)致不能產(chǎn)生重鏈的可變區(qū)重組，進(jìn)而導(dǎo)致B 細(xì)胞發(fā)育在前 B 細(xì)胞階段停止，缺少成熟B細(xì)胞。這類B 細(xì)胞缺陷小鼠模型廣泛應(yīng)用于免疫基礎(chǔ)機(jī)制研究以及作為免疫源性測試物品研究的宿主小鼠。該類抗體重鏈基因缺陷小鼠模型從出生就缺少成熟B細(xì)胞，基于成熟B細(xì)胞的重要作用，其缺失也導(dǎo)致小鼠其他免疫功能的異常，不利于正常免疫機(jī)制的研究。因此，迫切需求有一種可誘導(dǎo)性的B細(xì)胞缺陷小鼠模型，其可以在誘導(dǎo)劑的作用下，在特定時間內(nèi)造成B細(xì)胞缺陷，在其他時間段內(nèi)，維持正常狀態(tài)。

白喉毒素（DT）介導(dǎo)的細(xì)胞毒性非常高效，細(xì)胞質(zhì)中白喉毒素活性單個分子就足以殺死真核細(xì)胞，其作用機(jī)制嚴(yán)格依賴于其受體-肝素結(jié)合 EGF 樣生長因子前體（proHB-EGF，也稱為 DTR）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。DTR 結(jié)合DT并促進(jìn) DT 內(nèi)吞作用,入細(xì)胞質(zhì)后，DT催化延伸因子 2 的失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成終止并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。人類和靈長類動物細(xì)胞天然對DT 敏感，但鼠細(xì)胞對白喉毒素的殺傷不敏感。將靈長類動物的DTR轉(zhuǎn)入小鼠細(xì)胞可使小鼠對DT產(chǎn)生敏感。因此，可以借助細(xì)胞類型特異的啟動子驅(qū)動靈長類DTR在小鼠特定細(xì)胞類型表達(dá)，進(jìn)而通過給予小鼠白喉毒素，實現(xiàn)對特定細(xì)胞類型的可誘導(dǎo)殺傷。

哺乳類動物B細(xì)胞的分化發(fā)育過程主要可分為前B細(xì)胞、不成熟B細(xì)胞、 成熟B細(xì)胞、活化B細(xì)胞和漿細(xì)胞五個階段。Cd19分子在B細(xì)胞發(fā)育過程中，除漿細(xì)胞階段外，在B細(xì)胞發(fā)育的其他階段均廣泛表達(dá)。因此，Cd19驅(qū)動DTR在小鼠B細(xì)胞中的表達(dá)，通過給藥白喉毒素，有望實現(xiàn)可誘導(dǎo)的小鼠B細(xì)胞缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種構(gòu)建可誘導(dǎo)性B細(xì)胞缺陷小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。該方法利用Cd19分子為小鼠B細(xì)胞的標(biāo)記分子這一特性，通過將白喉毒素受體和綠色熒光蛋白定點插入到Cd19分子基因表達(dá)框，構(gòu)建了一個Cd19-IRES-DTR-EGFP（簡稱：Cd19-DTR）基因修飾小鼠模型，該模型可以實現(xiàn)小鼠內(nèi)源Cd19基因驅(qū)動白喉毒素受體和綠色熒光蛋白表達(dá)。利用該模型，發(fā)明人可以通過EGFP熒光表達(dá)標(biāo)記小鼠B細(xì)胞；可以通過在特定時間點或時間段內(nèi)給予小鼠白喉毒素將B細(xì)胞殺死，造成B細(xì)胞缺陷，對B細(xì)胞在特定生理、病理過程中的作用進(jìn)行研究。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以替換其他標(biāo)記物來標(biāo)記小鼠B細(xì)胞，比如tdTomato等。

具體的，包括如下內(nèi)容；

一種誘導(dǎo)B細(xì)胞缺陷小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1）gRNA靶位點篩選：在插入位點附近設(shè)計并合成識別靶位點的gRNA；