[發明專利]一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用

在審

• 申請號: 202111183847.4
• 申請日: 2021-10-11
• 公開（公告）號: CN114437958A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 李文;李雙勝;王國良;何月秋;王志龍;吳立威
• 申請（專利權）人: 寧波城市職業技術學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/38
• 代理公司: 東莞市卓易專利代理事務所(普通合伙) 44777
• 代理人: 江梅

本發明公開了一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其方法步驟為：S1:采取土樣；S2:土壤稀釋；S3：土樣菌涂板；S4：土樣菌單克隆濃縮；S5：制備農桿菌培養基；S6：濾紙片點樣；S7：拮抗菌篩選；本發明通過從土壤中提取土樣，在經過土壤稀釋、土樣菌涂板和土樣菌單克隆濃縮步驟，并通過制備農桿菌培養基培養，通過滅過菌的鑷子放入適當的無菌濾紙片，再將上述濃縮好的各個待測菌液吸取到不同的濾紙片，通過培養箱培養過夜，觀察抑菌圈的產生情況，篩選出拮抗菌，利用微生物對抗微生物減小對環境的破壞，降低根癌病的防治成本。

技術領域

本發明涉及一種生物防治技術領域，具體是一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用。

背景技術

根癌病(又名冠癭病)是我國園林花卉苗木上最容易發生、危害最為嚴重的根部病害，多發生于土壤偏堿地區。該病害是由一種土壤細菌-根癌農桿菌引起，該細菌除危害櫻花外，還能危害榆、月季等薔薇科植物，以及銀杏、石竹等室內外花木，其寄主涵蓋60科300余種植物。根癌病在發病初期，從植物的地上部分難以發現，一旦觀察到植物長勢不好時，病害已經非常嚴重，難以挽救。根癌病發病前，一般采用石硫合劑蘸根或者用硫酸鏈霉素灌根的方法，對根癌病有一定的治療作用。但是在發病后，該方法防效較差。也可以通過土壤熏蒸，降低病地中根癌農桿菌的數量，從而減少發病率。

但是，由于土壤熏蒸不僅殺死了致病菌，同時也殺死了土壤中一些其他的拮抗微生物，可能導致根癌病的復發，由此可見，現有的物理防治和化學防治等方法都存在一定的局限性，而生物防治，是利用微生物對抗微生物，可以在一定程度上預防根癌病的發生，還可以減小對環境的破壞，因此，找到對根癌農桿菌有拮抗作用的菌是防治的關鍵。目前我國對植物根癌病的生物防治主要以澳大利亞人分離出的菌株K84為主，但因其價格高昂，存在專利壁壘，防治成本高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一株具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其方法步驟為：

S1:采取土樣；

S2:土壤稀釋；

S3：土樣菌涂板；

S4：土樣菌單克隆濃縮；

S5：制備農桿菌培養基；

S6：濾紙片點樣；

S7：拮抗菌篩選。

作為本發明進一步的方案：所述S1中用小鏟子將表層的土壤刨開，取距離土表10cm深層且沒有小石子的土壤。

作為本發明再進一步的方案：所述S2中將采取的土樣放到50ml的EP管里，加入10ml的水，渦旋，靜止10分鐘，將其進行梯度稀釋，稀釋倍數為10¹，10²，10³。

作為本發明再進一步的方案：所述S3通過吸取50微升10³稀釋液進行涂板，放入28℃培養箱過夜，挑單克隆：將前一天涂好的板挑取單克隆，在1mlYEB液體培養基中搖床過夜培養，搖床的培養條件28℃，200rpm。

作為本發明再進一步的方案：所述S4通過將前一天挑好的單克隆離心，倒掉一部分上清，然后再渦旋混勻濃縮備用。

作為本發明再進一步的方案：所述S5將50ml的EP管里加入15ml的YEB固體培養基，待培養基晾至50℃左右時，迅速再加入1ml的CFCC1369根癌農桿菌菌液，將混合好的菌液倒入已有一層空白YEB固體培養基的培養皿。