[發(fā)明專利]一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111183847.4
• 申請日: 2021-10-11
• 公開（公告）號: CN114437958A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發(fā)明（設計）人: 李文;李雙勝;王國良;何月秋;王志龍;吳立威
• 申請（專利權）人: 寧波城市職業(yè)技術學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/38
• 代理公司: 東莞市卓易專利代理事務所(普通合伙) 44777
• 代理人: 江梅

1.一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：其方法步驟為：

S1:采取土樣；

S2:土壤稀釋；

S3：土樣菌涂板；

S4：土樣菌單克隆濃縮；

S5：制備農(nóng)桿菌培養(yǎng)基；

S6：濾紙片點樣；

S7：拮抗菌篩選。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S1中用小鏟子將表層的土壤刨開，取距離土表10cm深層且沒有小石子的土壤。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S2中將采取的土樣放到50ml的EP管里，加入10ml的水，渦旋，靜止10分鐘，將其進行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10¹，10²，10³。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S3通過吸取50微升10³稀釋液進行涂板，放入28℃培養(yǎng)箱過夜。挑單克隆：將前一天涂好的板挑取單克隆，在1mlYEB液體培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)，搖床的培養(yǎng)條件28℃，200rpm。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S4通過將前一天搖好的單克隆離心，倒掉一部分上清，然后再渦旋混勻濃縮備用。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S5將50ml的EP管里加入15ml的YEB固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基晾至50℃左右時，迅速再加入1ml的CFCC1369根癌農(nóng)桿菌菌液，將混合好的菌液倒入已有一層空白YEB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S6待培養(yǎng)基凝固之后用滅過菌的鑷子放入適當?shù)臒o菌濾紙片，再將上述濃縮好的各個待測菌液吸取5微升到不同的濾紙片上，靜置10分鐘后，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

8.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S7通過1-6天觀察抑菌圈的產(chǎn)生情況，選取培養(yǎng)24h后抑菌圈直徑大于20mm的菌液作為候選菌株。

9.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S7利用分子生物學及生物化學方法對拮抗菌進行分子鑒定，觀察其在培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)，通過利用細菌的16SrRNA引物F8(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/R1492(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增，通過目的片段測序、數(shù)據(jù)庫檢索，對拮抗菌進行分子鑒定。

10.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抑菌活性的假單胞菌及其提取方法和應用，其特征在于：所述S7從活體方面，對拮抗菌的拮抗效果進行分析驗證，初步明確其作用機理，選根癌農(nóng)桿菌CFCC1369以及拮抗菌分別進行培養(yǎng)，分別培養(yǎng)到OD600為0.8，然后將兩種菌等體積混合，以無菌水接種以及單獨農(nóng)桿菌接種一個月大苗齡的番茄莖干，接種后用菌液浸濕的無菌脫脂棉包裹，保濕48h后，25-28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，一個月后觀察接種部位發(fā)病情況。