[發(fā)明專(zhuān)利]一種提高CHO細(xì)胞同源重組效率的方法及其相關(guān)產(chǎn)品和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111180214.8
• 申請(qǐng)日: 2021-10-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113881703B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王晶;孫照霖;王傳杰;王明;喬春霞;羅龍龍;肖鶴;陳國(guó)江;李新穎;涂凱;劉金青;馮健男;沈倍奮
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/90;C07K14/47;C12N5/10;C12N15/113;C12N15/67;C12Q1/02
• 代理公司: 北京預(yù)立生科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11736
• 代理人: 朱萍;孟祥斌

本發(fā)明公開(kāi)了一種提高CHO細(xì)胞同源重組效率的方法及其相關(guān)產(chǎn)品和應(yīng)用，本發(fā)明首次在CHO細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并證明了單獨(dú)敲除POLQ基因，抑制al?NHEJ修復(fù)途徑可高效提高CHO細(xì)胞同源重組效率，構(gòu)建得到的敲除POLQ基因CHO細(xì)胞能夠提高表達(dá)外源抗體時(shí)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的效率，并進(jìn)一步提高產(chǎn)物的表達(dá)量，在重組蛋白類(lèi)生物藥物的制備中具有較好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種提高同源重組效率的方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種提高CHO細(xì)胞同源重組效率的方法及其相關(guān)產(chǎn)品和應(yīng)用。

背景技術(shù)

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)是工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白類(lèi)生物藥物最主要的細(xì)胞株，自1957年Dr.Theodore T.Puck從成年雌性倉(cāng)鼠卵巢分離獲得第一株野生型CHO細(xì)胞以來(lái)，經(jīng)過(guò)多次改造逐漸形成以DHFR-CHO(缺失二氫葉酸還原酶)表達(dá)系統(tǒng)和GS-CHO(缺失谷氨酰胺合成酶)表達(dá)系統(tǒng)為主的商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)。目前，CHO細(xì)胞已經(jīng)是用于包括基因工程抗體類(lèi)藥物在內(nèi)的重組糖蛋白藥物生產(chǎn)的首選宿主細(xì)胞，主要有以下原因：1、CHO細(xì)胞能夠較好地適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，在生物反應(yīng)器中可獲得較高的密度，有利于工業(yè)上大規(guī)模培養(yǎng)；2、CHO細(xì)胞能夠在翻譯后進(jìn)行修飾，尤其是在蛋白糖基化方面，與人類(lèi)基本一致；3、利于外源基因整合，具有外源重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；4、CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，是一種非分泌型細(xì)胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，因此十分有利于下游目標(biāo)蛋白的分離純化；5、CHO細(xì)胞能夠在無(wú)血清和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠確保不同批次培養(yǎng)的重復(fù)性；6、CHO細(xì)胞不易傳播人類(lèi)感染病毒。目前，構(gòu)建工業(yè)化穩(wěn)轉(zhuǎn)重組細(xì)胞株的方法主要是通過(guò)隨機(jī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)或者有專(zhuān)利保護(hù)的商業(yè)化的位點(diǎn)特異重組酶為基礎(chǔ)的FLIP-IN技術(shù)進(jìn)行制備，存在外源基因重組效率不高以及篩選高表達(dá)工程細(xì)胞株耗時(shí)耗力等方面的問(wèn)題。

以同源重組為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)(Gene targeting)的出現(xiàn)，能定點(diǎn)的敲入外源基因(Gene insertion)，解除轉(zhuǎn)基因技術(shù)隨機(jī)插入的問(wèn)題，同時(shí)結(jié)合ROSA26、H11、HPRT、c12orf35等安全位點(diǎn)技術(shù)，可以將外源基因定向的整合到安全位點(diǎn)，這樣可以保證外源基因持續(xù)穩(wěn)定的高表達(dá)。然而傳統(tǒng)的基因打靶效率很低、目的基因大概率進(jìn)行隨機(jī)整合而非定點(diǎn)敲入，而且通常在小鼠的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中完成。在大型哺乳動(dòng)物原代及其他類(lèi)型細(xì)胞的基因打靶效率更低，大大限制了其應(yīng)用。直到第一代鋅指核酸酶(Zinc-fingernucleaaes，ZFNs)基因編輯技術(shù)，以及隨后的第二代轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)、第三代規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，才提高了此技術(shù)的效率及應(yīng)用面。2010年Orlando SJ等研究人員首次利用ZFNs技術(shù)以寡核苷酸(Oligonucleotide)或者短的供體載體為模板在CHO細(xì)胞的內(nèi)源GS基因進(jìn)行非同源重組依賴(lài)的基因敲入。隨后Cristea于2013年首次利用ZFNs和TALENs技術(shù)結(jié)合體內(nèi)雙切供體載體，完成CHO細(xì)胞上的非同源臂依賴(lài)的基因敲入。雖然目的基因可以整合到目的基因區(qū)域，但并不是精確的同源重組，因?yàn)榧词褂谢蚓庉嫾夹g(shù)，CHO細(xì)胞自身同源重組效率依然很低。2017年Kawabe Y研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9和MMEJ的PITCh技術(shù)成功對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行基因敲入，同樣也是非同源重組依賴(lài)的。2016年Jae Seong Lee團(tuán)隊(duì)首次利用CRISPR/Cas9、同源重組技術(shù)及熒光報(bào)告系統(tǒng)富集技術(shù)在CHO細(xì)胞中完成了目的基因的定點(diǎn)敲入。雖然少數(shù)研究證明CHO細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)目的基因精確的定點(diǎn)敲入，但總體的同源重組效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目的基因隨機(jī)整合效率。因此，提高CHO細(xì)胞同源重組效率成為了目前本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。