[發(fā)明專利]一種提高CHO細胞同源重組效率的方法及其相關產品和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111180214.8
• 申請日: 2021-10-11
• 公開（公告）號: CN113881703B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設計）人: 王晶;孫照霖;王傳杰;王明;喬春霞;羅龍龍;肖鶴;陳國江;李新穎;涂凱;劉金青;馮健男;沈倍奮
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫(yī)學研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C07K14/47;C12N5/10;C12N15/113;C12N15/67;C12Q1/02
• 代理公司: 北京預立生科知識產權代理有限公司 11736
• 代理人: 朱萍;孟祥斌

1.一種提高CHO細胞同源重組效率的方法，其特征在于，所述方法包括敲除CHO細胞中的POLQ基因和/或抑制CHO細胞中POLQ基因的表達。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟(1)：利用基因編輯技術將CHO細胞中的POLQ基因敲除和/或失活；

步驟(2)：細胞分選，對經細胞分選得到的POLQ基因敲除和/或失活的CHO細胞進行鑒定和篩選。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述基因編輯技術包括CRISPR/Cas9、Cas12a、SpRY-Cas9、SpG-Cas9、ZFNs或TALENs。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將CHO細胞中的POLQ基因敲除包括如下步驟：

步驟(a)：針對倉鼠POLQ基因設計靶向POLQ基因的sgRNA的靶向識別區(qū)域；

步驟(b)：將步驟(a)得到的成對的sgRNA退火、配對，獲得帶有粘性末端的雙鏈DNA片段；

步驟(c)：將步驟(b)得到的雙鏈DNA片段與酶切后的Cas9載體連接，獲得重組表達載體；

步驟(d)：將步驟(c)得到的重組表達載體轉染CHO細胞，培養(yǎng)，獲得POLQ基因敲除的CHO細胞。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的sgRNA的靶向識別區(qū)域的序列如SEQ ID NO:2所示。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述的退火的條件為100℃、5min。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的Cas9載體包括pX330載體、pX460載體、pX459載體、pX458載體、pX552載體、pX551載體、pX856載體、pX855載體、pX854載體、pX853載體、pX852載體、pX851載體、pX603載體、pX602載體、pX601載體、pX600載體、pX399載體、pX398載體、pX396載體、pX395載體、pX393載體、pX389載體、pX388載體、pX387載體、pX386載體、pX335載體、pX334載體、pX260載體或pX165載體。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的Cas9載體為pX330載體。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的Cas9載體為BbsI限制性核酸內切酶特異性切割pX330載體后得到的特異線性質粒。

11.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(d)中所述的轉染的過程包括將步驟(c)得到的重組表達載體與綠色熒光蛋白表達質粒共轉染CHO細胞。

12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，所述綠色熒光蛋白表達質粒為pmax-GFP。

13.一種定點整合外源基因的CHO工程細胞株，其特征在于，所述CHO工程細胞株為敲除CHO細胞中的POLQ基因和/或抑制CHO細胞中POLQ基因的表達得到的細胞株。