[發明專利]點蜂緣蝽突觸融合蛋白結合蛋白RpSDP及其應用

有效

• 申請號: 202111179160.3
• 申請日: 2021-10-09
• 公開（公告）號: CN114507669B
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發明（設計）人: 孫宗濤;黃海劍;魏中艷;李俊敏;張傳溪;陳劍平
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04;C12N15/89
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發明提供點蜂緣蝽突觸融合蛋白結合蛋白的應用，屬于基因工程領域。根據本發明提供的RpSDP基因的dsRNA制劑，將其導入點蜂緣蝽體內，可有效地殺滅點蜂緣蝽，避免其為害農作物。本發明特異地針對點蜂緣蝽，對哺乳動物、魚蝦類、天敵昆蟲和授粉昆蟲無害，具有見效快、致死率高、環境友好等優勢。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，涉及一種點蜂緣蝽突觸融合蛋白結合蛋白RpSDP的dsRNA合成、dsRNA導入點蜂緣蝽體內以及該基因在防治點蜂緣蝽相關病蟲害中的應用。

背景技術

點蜂緣蝽(Riptortus?pedestris)是大豆田間常見的刺吸式害蟲，主要通過其刺吸式口器持續刺吸植株和種子汁液來獲取養分。點蜂緣蝽的持續取食會導致大豆植株的發育不良甚至死亡，且受到侵害的大豆種子也往往無法正常發育，最終導致大豆的減產。目前點蜂緣蝽的防控以化學農藥為主，而傳統農藥的大面積使用不僅造成嚴重的環境問題，還使得點蜂緣蝽產生了抗藥性，不利于農業的可持續發展。因此，開發新的點蜂緣蝽防治技術是解決當前化學農藥濫用的良好途徑。

RNA干擾技術是近年來生命科學研究的熱點。它通過小分子雙鏈RNA特異性地降解或抑制靶標基因mRNA表達，進而抑制或關閉特定基因。RNA干擾技術具有高特異性、高效率、便于操作等優點。目前，該技術已廣泛應用于多種農業害蟲的防控，即通過向昆蟲體內導入特異的dsRNA，使得昆蟲的特定功能喪失從而控制害蟲的為害。近年來，已有研究人員借助RNA干擾技術以點蜂緣蝽為實驗材料進行相關功能研究，例如：TOMOKO?IKENO團隊研究了生物鐘基因Clock在Riptortus?pedestris的晝夜節律中的作用和繁殖滯育的光周期調控(TOMOKO?IKENO?et?al，2013),Jang團隊發現Duox表達的氣管特異性，通過RNAi干擾下調該基因導致其呼吸系統的崩潰(Seonghan?Jang?et?al，2021)；然而，這些研究更多的是機理性研究，應用性不強，目前仍缺乏更有效、更環保的點蜂緣蝽病蟲害防治技術；基于上述現有技術的缺陷，本專利發明人通過靶向對點蜂緣蝽生存必須的突觸融合蛋白結合蛋白(syntaxin-binding?protein，SDP)基因，建立點蜂緣蝽的RNA干擾系統以及點蜂緣蝽SDP(RpSDP)基因突變體；SDP廣泛參與昆蟲的囊泡運輸和神經遞質分泌，在昆蟲神經遞質傳導過程中的發揮重要作用；發明人首次測定了點蜂緣蝽基因組(HUANG?et?al，2021)，本發明在此基礎上鑒定了點蜂緣蝽的RpSDP基因，通過建立點蜂緣蝽的RNA干擾系統以及點蜂緣蝽RpSDP基因突變體，為點蜂緣蝽的防治提供序列和數據基礎。

發明內容

本發明克隆點蜂緣蝽突觸融合蛋白結合蛋白RpSDP的部分序列，通過體外合成方法獲得RpSDP基因的dsRNA，并將其導入點蜂緣蝽體內。沉默RpSDP基因能夠顯著降低點蜂緣蝽在大豆植株上的存活率，從而達到防控點蜂緣蝽的目的。

一方面，本發明涉及一種點蜂緣蝽突觸融合蛋白結合蛋白RpSDP基因,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示或與SEQ?ID?NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸或由其組成；

另一方面，本發明一種點蜂緣蝽突觸融合蛋白結合蛋白RpSDP基因,其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1所編碼的氨基酸或與SEQ?ID?NO:1編碼的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其組成；

另一方面，本發明還涉及一種RpSDP基因的克隆方法，步驟包括：

(1)取點蜂緣蝽若蟲，Trizol法提取總RNA，并利用點蜂緣蝽總RNA為模板合成cDNA第一條鏈；

(2)以點蜂緣蝽cDNA為模板，以序列如SEQ?ID?NO.2所示的上游引物和序列如SEQID?NO.3所示的下游引物進行PCR擴增，得到含有的基因片段序列如SEQ?ID?NO:4所示的PCR擴增產物；