[發明專利]結核分枝桿菌融合蛋白AR2及其構建與表達純化方法和應用

有效

• 申請號: 202111176965.2
• 申請日: 2021-10-09
• 公開（公告）號: CN113999865B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 王曉春;施自倫;李輝;蔡霞;程龍強
• 申請（專利權）人: 安徽理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C07K14/35;C07K1/22;C12N1/21;A61K39/04;A61K39/39;A61P31/06;C12R1/32
• 代理公司: 西安研創天下知識產權代理事務所(普通合伙) 61239
• 代理人: 陳明星

本發明公開了結核分枝桿菌融合蛋白AR2及其構建與表達純化方法和應用，所述構建與表達純化方法包括以下步驟，S1：從結核分枝桿菌H37Rv全基因組序列中提取Rv1988及Rv1886c編碼的基因序列；S2：以pET28a、pET30b作為載體，構建pET30b?Rv1988重組質粒和pET28a?Rv1886c重組質粒；S3：根據提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988?Rv1886c，也即融合蛋白AR2；S4：以質粒pET28a作為載體，構建重組質粒pET28a?AR2；S5：將步驟S2和步驟S4中構建的重組質粒轉入表達載體E.coli?BL21菌株中；S6：融合蛋白AR2及亞組份蛋白rRv1988、rRv1886c的表達與純化，將本發明中的融合蛋白AR2和佐劑進行聯合構建結核亞單位疫苗，該疫苗可在小鼠體內誘導較強的細胞免疫應答并促進記憶性T細胞的產生，后期有望成為更為有效的結核病新型候選疫苗。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及結核分枝桿菌融合蛋白AR2及其構建與表達純化方法和應用。

背景技術

結核分枝桿菌(MTB)是結核病的病原體，是人類病原體中最能適應人體環境的一種，它可以以潛伏狀態在人體巨噬細胞內長時間存活。據估計，全球有三分之一的人口存在結核分枝桿菌潛伏感染，其中這一人群中有10％的人口在免疫功能低下時由潛伏期結核進展為活動性結核。對于結核病的控制策略很大程度上依賴于疾病的診斷和至少三種不同抗癆藥物長期的治療。但這導致了多重耐藥結核的不斷發展。另外，由于艾滋病病毒的流行，并發的結核分枝桿菌感染也逐漸成為亟待解決的問題。全球結核病對公共衛生健康的影響日益嚴重，迫切需要研制一種新的抗結核疫苗。

目前所使用的結核疫苗卡介苗(BCG)，自1921年開始應用于臨床，是一種減毒牛結核分枝桿菌活疫苗。研究證實，它能夠有效預防新生兒和兒童患嚴重的腦膜結核及全身粟粒性結核病，但是不能有效的防止成人肺結核的發生。繼BCG疫苗應用80多年以來，全球尚未研制出有效的新型抗結核疫苗。因此，為了在全球范圍內徹底消滅結核病，我們迫切需要研制更為有效的結核病新型疫苗。

發明內容

針對上述存在的問題，本發明旨在提供結核分枝桿菌融合蛋白AR2及其構建與表達純化方法和應用，通過一種全新的結核分枝桿菌融合蛋白AR2和佐劑進行聯合構建結核亞單位疫苗，該疫苗可在小鼠體內誘導較強的細胞免疫應答并促進記憶性T細胞的產生，后期有望成為更為有效的結核病新型候選疫苗。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

結核分枝桿菌融合蛋白AR2的構建與表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟，

S1：從結核分枝桿菌H37Rv全基因組序列中提取Rv1988及Rv1886c編碼的基因序列；

S2：以pET28a、pET30b作為載體，構建pET30b-Rv1988重組質粒和pET28a-Rv1886c重組質粒；

S3：根據提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988-Rv1886c，也即融合蛋白AR2的融合基因；

S4：以質粒pET28a作為載體，構建重組質粒pET28a-AR2；

S5：將步驟S2和步驟S4中構建的重組質粒轉入表達載體E.coli?BL21菌株中；

S6：融合蛋白AR2及亞組份蛋白rRv1988、rRv1886c的表達與純化。

進一步的，步驟S2的具體操作包括以下步驟，

S201：參照原核表達載體pET28a、pET30b的多克隆位點設計Rv1988及Rv1886c對應的引物，以H37Rv基因組作為模板進行PCR基因擴增；

S202：對PCR基因擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳；