[發(fā)明專利]結(jié)核分枝桿菌融合蛋白AR2及其構(gòu)建與表達(dá)純化方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111176965.2
• 申請日: 2021-10-09
• 公開（公告）號: CN113999865B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉春;施自倫;李輝;蔡霞;程龍強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C07K14/35;C07K1/22;C12N1/21;A61K39/04;A61K39/39;A61P31/06;C12R1/32
• 代理公司: 西安研創(chuàng)天下知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61239
• 代理人: 陳明星

1.結(jié)核分枝桿菌融合蛋白AR2的構(gòu)建與表達(dá)純化方法，其特征在于，包括以下步驟，

S1：從結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組序列中提取Rv1988及Rv1886c編碼的基因序列；

S2：以pET28a、pET30b作為載體，構(gòu)建pET30b-Rv1988重組質(zhì)粒和pET28a-Rv1886c重組質(zhì)粒；

S3：根據(jù)提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988-Rv1886c，也即融合蛋白AR2的融合基因；

S4：以質(zhì)粒pET28a作為載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-AR2；

S5：將步驟S2和步驟S4中構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)載體E.coli?BL21菌株中；

S6：融合蛋白AR2及亞組份蛋白rRv1988、rRv1886c的表達(dá)與純化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白AR2的構(gòu)建與表達(dá)純化方法，其特征在于，步驟S2的具體操作包括以下步驟，

S201：參照原核表達(dá)載體pET28a、pET30b的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)Rv1988及Rv1886c對應(yīng)的引物，以H37Rv基因組作為模板進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增；

S202：對PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳；

S203：目的基因Rv1988和Rv1886c回收與驗(yàn)證；

S204：將回收的目的基因Rv1988、Rv1886c，以及原核表達(dá)載體pET28a、pET30b分別進(jìn)行雙酶切；

S205：對雙酶切反應(yīng)液進(jìn)行純化；

S206：將純化后的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，Rv1988與質(zhì)粒pET30b連接，Rv1886c與質(zhì)粒pET28a連接；

S207：將步驟S206中得到的兩個(gè)連接體系分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli?DH5α菌株中，置于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其長出菌落，每個(gè)菌落即為一個(gè)單克隆；

S208：于超凈臺內(nèi)取高壓滅菌的潔凈玻璃試管，向其中加入LB液體培養(yǎng)基和抗生素，挑取步驟S207中培養(yǎng)得到單克隆置于液體培養(yǎng)基中，將試管置于搖床內(nèi)搖菌；

S209：從步驟S208的液體培養(yǎng)基中抽提pET30b-Rv1988重組質(zhì)粒和pET28a-Rv1886c重組質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白AR2的構(gòu)建與表達(dá)純化方法，其特征在于，步驟S202的具體操作包括以下步驟，

1)：1％瓊脂糖凝膠的制備；以萬分之一天平稱取瓊脂糖0.2g至燒杯，取20ml?1×TAE溶液，倒入燒杯內(nèi)，微波爐中火加熱1min；取出，待冷卻至50℃時(shí)，加2μl?Gelview染料，搖勻，倒入制膠模具中；室溫冷卻30min，得1％瓊脂糖凝膠，將其取出置于水平電泳槽內(nèi)；

2)：加樣；在1％瓊脂糖凝膠的膠孔內(nèi)加入4μl核酸標(biāo)志物Marker?DL2000，25μlPCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)：電泳；打開電泳儀，并與電泳槽通電，調(diào)整電泳儀電壓為100V，電流為100mA，電泳時(shí)間設(shè)置為25min，Start開始電泳；

4)：成像；電泳儀提示結(jié)束后關(guān)閉儀器，取出電泳完成的瓊脂糖膠，將其置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc?XRS+中，運(yùn)行成像并拍照保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白AR2的構(gòu)建與表達(dá)純化方法，其特征在于，步驟S205的具體操作包括以下步驟，

1)：將雙酶切產(chǎn)物裝入潔凈1.5ml?EP管，以無菌水補(bǔ)至100μl，再向其中加入500μl含有異丙醇的緩沖液中，充分混勻；

2)：混勻后移至吸附柱內(nèi)，以轉(zhuǎn)速為8000rcf離心30s，將流出液再移至吸附柱內(nèi)，8000rcf離心30s，棄流出液；

3)：將500μl含有乙醇的漂洗液加入到吸附柱內(nèi)，9000rcf離心30s，棄流出液；

4)：重復(fù)操作步驟3)；

5)：將空吸附柱以轉(zhuǎn)速為9000rcf離心1min；

6)：開蓋，室溫放置5min以揮發(fā)殘留乙醇；

7)：于水浴鍋預(yù)熱洗脫緩沖液至60℃；

8)：向吸附柱膜中央加入35μl預(yù)熱至60℃的洗脫緩沖液，40℃靜置溫浴2min，以轉(zhuǎn)速為9000rcf離心1min，得洗脫液，取3.5μl進(jìn)行驗(yàn)證，余下于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>