[發(fā)明專(zhuān)利]一種養(yǎng)生酒對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌抑制作用有效性的驗(yàn)證方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111176212.1
• 申請(qǐng)日: 2021-10-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113916885A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白玉鋒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 成程科技集團(tuán)有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/84
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/84;G01N1/30;G01N1/36;C12Q1/18;C12Q1/58
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• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種養(yǎng)生酒對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌抑制作用有效性的驗(yàn)證方法，其特征在于：具體包括如下步驟，

(1)、準(zhǔn)備充足的幽門(mén)螺桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)小鼠70只，18～22g，雌雄各半；

(2)、分組：將所有小鼠隨機(jī)分為7組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組、養(yǎng)生酒高劑量組、養(yǎng)生酒低劑量組及普通白酒高劑量組、普通白酒低劑量組，每組10只，再將實(shí)驗(yàn)小鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)一周；

(3)、細(xì)菌培養(yǎng)：將幽門(mén)螺桿菌菌株在超凈工作臺(tái)中以每個(gè)平板100ul菌懸液的量劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，待菌液在培養(yǎng)基上吸干后，將培養(yǎng)基倒置放于厭氧培養(yǎng)袋中，而后迅速將微需氧產(chǎn)氣包放入培養(yǎng)袋中并密封，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h；待細(xì)菌長(zhǎng)滿平板，挑取典型菌落進(jìn)行幽門(mén)螺桿菌菌株試紙鑒定，試紙顏色由黃變紫后，用生理鹽水輕輕洗下菌落，測(cè)量菌液OD值；

(4)、動(dòng)物造模：采用培養(yǎng)并收集的幽門(mén)螺桿菌菌株，菌懸液濃度用生理鹽水調(diào)節(jié)為1×10⁹CFU/ml；造模前將小鼠禁食不禁水24h，除空白組外均先灌胃5％碳酸氫鈉0.2ml/只，30min后再灌胃給予幽門(mén)螺桿菌菌液0.2ml/只/次，灌胃后再禁食禁水3h，之后正常攝食飲水；隔天感染一次，共8次；空白對(duì)照組給予等量生理鹽水；

(5)、給藥：造模結(jié)束后開(kāi)始給藥，給陽(yáng)性藥物組喂食陽(yáng)性藥物，養(yǎng)生酒高劑量組喂食49.4ml/kg的養(yǎng)生酒，養(yǎng)生酒低劑量組喂食24.7ml/kg的養(yǎng)生酒，普通白酒高劑量組喂食與養(yǎng)生酒同度數(shù)的普通白酒49.4ml/kg，普通白酒低劑量組喂食與養(yǎng)生酒同度數(shù)的普通白酒24.7ml/kg，其中均以0.2ml/10g/只灌胃給藥，空白組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天一次，連續(xù)給藥20天；給藥期間各組自由飲水，正常進(jìn)食；

(6)、模型檢測(cè)：末次灌胃菌液2h后脫頸處死小鼠，快速完整取胃，觀察胃部形態(tài)變化；將胃沿胃大彎剪開(kāi)，展平于手術(shù)臺(tái)上，小心刮取胃黏膜組織進(jìn)行尿素酶試紙檢測(cè)；

(7)、模型復(fù)制評(píng)價(jià)：若模型小鼠尿素酶試紙檢測(cè)試紙由黃變紫，結(jié)果呈顯陽(yáng)性；空白組小鼠試紙檢測(cè)呈陰性，空白小鼠胃紅潤(rùn)光澤，整體完整無(wú)變形，；而模型組小鼠，胃外部呈現(xiàn)深紫色，表面皺縮、凹凸不平，出現(xiàn)明顯病變；將胃沿胃大彎展開(kāi)后，可見(jiàn)模型組出現(xiàn)點(diǎn)星狀出血，可判斷模型復(fù)制成功；

(8)、體征觀察：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，正常進(jìn)食飲水，期間定期觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體征情況；

(9)、胃部大體形態(tài)學(xué)觀察：末次給藥24h后，采用頸椎脫臼處死小鼠，使用75％酒精腹部皮膚消毒，以組織剪自會(huì)陰至劍突剪開(kāi)，離斷隔肌至人工氣胸，暴露腹腔并仔細(xì)分離胃周結(jié)締組織，完整取出全胃標(biāo)本；用生理鹽水清洗胃標(biāo)本，后用吸水紙輕輕吸干，觀察胃部形態(tài)學(xué)變化；

(10)、胃竇部粘膜組織尿素酶檢測(cè)：將胃沿胃大彎剪開(kāi)，去除胃中殘留食物等雜質(zhì)，然后用生理鹽水將胃組織反復(fù)沖洗干凈，輕輕刮取胃竇部粘膜組織，用幽門(mén)螺桿菌試紙進(jìn)行尿素酶檢測(cè)，并進(jìn)行結(jié)果判定；

(11)、胃組織病理學(xué)HE染色：沿胃大彎側(cè)剪開(kāi)胃標(biāo)本，然后用生理鹽水將胃組織反復(fù)沖洗干凈；接著以大頭針將沖洗干凈的胃標(biāo)本展平并固定于塑料泡沫板上，置于4％多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)，然后胃組織HE染色，最后倍鏡下觀察胃黏膜炎癥發(fā)生情況及病理變化；

(12)、肝組織病理學(xué)HE染色：將小鼠脫頸處死，打開(kāi)腹腔，分離出肝臟；將肝臟放入4％多聚甲醛中固定，將固定好的肝臟制作成石蠟切片并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；

(13)、根據(jù)體征觀察結(jié)果、胃部大體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果、胃竇部粘膜組織尿素酶檢測(cè)結(jié)果、胃組織病理學(xué)HE染色后觀察結(jié)果和肝組織病理學(xué)HE染色后觀察結(jié)果判斷養(yǎng)生酒對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌抑制作用有效性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種養(yǎng)生酒對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌抑制作用有效性的驗(yàn)證方法，其特征在于：所述(5)中的陽(yáng)性藥物配方為奧美拉唑400nmol/kg、甲硝唑14.2mg/kg和克拉霉素7.15mg/kg。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種養(yǎng)生酒對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌抑制作用有效性的驗(yàn)證方法，其特征在于：所述(8)中的體征情況包括：精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、毛發(fā)光澤度、是否出現(xiàn)活動(dòng)異樣及攝食、飲水情況，動(dòng)物體重。