[發明專利]定量檢測無細胞蛋白質合成系統目的蛋白產量及篩選高催化活性酶蛋白的方法

在審

• 申請號: 202111174703.2
• 申請日: 2021-10-09
• 公開（公告）號: CN114019169A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 林影;袁清焱;梁書利
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64;C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/54;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜

本發明公開了一種定量檢測無細胞蛋白質合成系統目的蛋白產量及篩選高催化活性酶蛋白的方法。該定量檢測CFPS系統目的蛋白產量的方法使用分割熒光蛋白自發結合發出的熒光強度值，可快速地分析CFPS系統中目的蛋白的表達量，有利于CFPS系統中目的蛋白表達量的快速檢測；同時，基于該方法，通過計算各個酶蛋白催化得到的產物量與分割熒光蛋白自發結合后的熒光強度值的比值，可快速篩選高催化活性的酶同系物，無需進行常規的大腸轉化?表達?純化流程，大大節省了時間與材料成本，提高了篩選速度，且避免了由于蛋白表達量過低而引起的高催化活性蛋白的漏篩風險，有利于實現高催化活性酶蛋白快速準確的篩選。

技術領域

本發明涉及分子生物學與合成生物學技術領域，特別涉及一種定量檢測無細胞蛋白質合成系統目的蛋白產量及篩選高催化活性酶蛋白的方法。

背景技術

分割熒光蛋白是一種對熒光蛋白的改造技術：在特定位置將完整的熒光蛋白分割成兩段或多段多肽，這些多肽鏈單獨存在時都不會產生熒光，而當同時存在時則會自發組裝形成完整的熒光蛋白并產生熒光。通過將分割的短鏈熒光蛋白多肽與靶標蛋白融合表達并檢測其與另一段熒光蛋白多肽的組裝情況，該技術已成功應用于體內或體外的蛋白可溶性表達分析、蛋白質在胞內的定位與運輸監測、蛋白與蛋白相互作用檢測等方面。

無細胞蛋白質合成(Cell-free protein synthesis，CFPS)系統利用細胞抽提物中的酶和輔助因子以及外源補充的底物和能量物質，以外源DNA或mRNA為模板實現目的蛋白的體外合成。與基于細胞的蛋白質表達平臺相比，CFPS主要具有三個優勢：1)無需維持細胞存活與生長，CFPS可以生產細胞體系難以生產或對細胞有潛在毒性的蛋白質；2)由于無需進行繁瑣費時的克隆操作，該系統表達多種蛋白質具有更快的速度和更好的靈活性；3)該系統的開放性使得能夠方便地對其進行更加直接、精細的調控。由于上述優勢，CFPS已經逐漸被應用于抗體的高通量表達與篩選、蛋白質修飾的快速表征、生物合成途徑的原型設計與代謝工程改造等領域。對CFPS系統表達的目的蛋白進行定量是應用CFPS的基礎，但由于CFPS系統的細胞提取物中存在多種細胞內源的酶蛋白，故無法使用常用簡便的蛋白質定量方法，如Bradford法對表達的目的蛋白進行定量檢測。而目前常用的檢測CFPS系統目的蛋白產量的方法為首先用放射性C元素標記表達的蛋白，之后再使用液滴閃縮計數與放射自顯影實現蛋白定量，這種定量方法操作繁瑣費時，需要嫻熟的實驗技巧與專業的設備條件。故目前仍缺少一種能夠快速簡便地實現對CFPS系統表達的蛋白進行定量的方法。

從不同物種來源的酶同系物中篩選具有高催化活性的酶蛋白是提高生物合成途徑目的產物產量與生產效率的常用方法，但這一過程因通常需要進行多種蛋白的表達與純化而往往費時費力。基于以上背景，建立一種快速簡便的定量檢測CFPS系統目的蛋白產量及快速篩選高催化活性酶蛋白的方法顯得十分重要。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種定量檢測無細胞蛋白質合成系統目的蛋白產量的方法。

本發明的另一目的在于提供所述定量檢測無細胞蛋白質合成系統目的蛋白產量的方法的應用。

本發明的又一目的在于提供一種快速篩選高催化活性酶蛋白的方法。

本發明的再一目的在于提供所述快速篩選高催化活性酶蛋白的方法的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種定量檢測無細胞蛋白質合成(CFPS)系統目的蛋白產量的方法，包括如下步驟：

(1)構建表達融合蛋白的質粒

將目的蛋白(酶蛋白)的基因序列和分割熒光蛋白短鏈多肽通過linker序列連接，得到目的蛋白-分割熒光蛋白短鏈多肽的DNA序列，然后將DNA序列插入到質粒載體上，得到表達融合蛋白的質粒；

(2)制備融合蛋白溶液