[發(fā)明專利]定量檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量及篩選高催化活性酶蛋白的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111174703.2
• 申請日: 2021-10-09
• 公開（公告）號: CN114019169A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林影;袁清焱;梁書利
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64;C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/54;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜

1.一種定量檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒

將目的蛋白的基因序列和分割熒光蛋白短鏈多肽通過linker序列連接，得到目的蛋白-分割熒光蛋白短鏈多肽的DNA序列，然后將DNA序列插入到質(zhì)粒載體上，得到表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒；

(2)制備融合蛋白溶液

將步驟(1)中得到的表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于抗性平板上，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子；然后將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化，得到目的蛋白-分割熒光蛋白短鏈多肽的融合蛋白溶液；

(3)制備含融合蛋白的CFPS反應(yīng)液

將步驟(1)中得到的表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒進(jìn)行無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)，得到含有目的蛋白-分割熒光蛋白短鏈多肽的融合蛋白的CFPS反應(yīng)液；

(4)制備含有分割熒光蛋白長鏈多肽的發(fā)光液

將分割熒光蛋白長鏈多肽的DNA序列插入到質(zhì)粒載體上，得到表達(dá)分割熒光蛋白長鏈多肽的載體，然后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于抗性平板上，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子；再將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，得到含有分割熒光蛋白長鏈多肽的發(fā)光液；

(5)制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將步驟(2)中得到的目的蛋白-分割熒光蛋白短鏈多肽的融合蛋白溶液配制成至少5個(gè)濃度梯度的融合蛋白溶液，然后分別加入到步驟(4)中得到的含有分割熒光蛋白長鏈多肽的發(fā)光液中，在4℃條件下孵育8～16h，再檢測其熒光強(qiáng)度值，并根據(jù)熒光強(qiáng)度值及融合蛋白溶液的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(6)檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)體系中目的蛋白的產(chǎn)量

將步驟(3)中得到的含有目的蛋白-分割熒光蛋白短鏈多肽的融合蛋白的CFPS反應(yīng)液加入到步驟(4)中得到的含有分割熒光蛋白長鏈多肽的發(fā)光液中，在4℃條件下孵育8～16h，然后檢測其熒光強(qiáng)度，再根據(jù)步驟(5)中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到目的蛋白的產(chǎn)量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的分割熒光蛋白短鏈多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟(1)中所述的linker序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步驟(4)中所述的分割熒光蛋白長鏈多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的目的蛋白包括核糖激酶、核糖磷酸焦磷酸激酶或煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；

步驟(1)中所述的質(zhì)粒載體為pET23a、pET28a或pET30a載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的目的蛋白包括來源于人、細(xì)菌或古菌的核糖激酶、核糖磷酸焦磷酸激酶或煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；

步驟(1)中所述的質(zhì)粒載體為pET28a載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量的方法，其特征在于：

步驟(2)和(4)中所述的誘導(dǎo)表達(dá)為利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

步驟(2)和(4)中所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)；

步驟(2)和(4)中所述的抗性平板為含有卡那霉素的LB固體平板；

步驟(5)中所述的目的蛋白-分割熒光蛋白短鏈多肽的融合蛋白的用量為按其在所述反應(yīng)的終濃度為0.0125～2pmol/μL添加計(jì)算；

步驟(5)和(6)中所述的孵育的時(shí)間為10～12h；

步驟(5)和(6)中所述的熒光強(qiáng)度值為在激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為520nm下測定的熒光強(qiáng)度值。

6.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述定量檢測無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)目的蛋白產(chǎn)量的方法在篩選高催化活性酶蛋白中的應(yīng)用。