[發(fā)明專利]攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體及其構建方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111162470.4
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN113755525A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 張大生
• 申請（專利權）人: 長沙愛科博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/64;C12N15/31;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 長沙七源專利代理事務所(普通合伙) 43214
• 代理人: 劉伊旸;周曉艷

本發(fā)明提供一種攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組腺相關病毒載體及其構建方法與應用，將肺炎支原體P216基因插入骨架質粒中，形成攜帶目的基因的重組腺相關病毒DNA載體質粒，將重組腺相關病毒DNA載體質粒、可提供AAV2的復制蛋白和AAV5的外殼蛋白的包裝質粒與輔助質粒共轉染宿主細胞，進而獲得攜帶P216基因的重組5型腺相關病毒載體rAAV5?P216，所述P216基因的序列如SEQ ID NO:1所示。上述重組病毒載體具有靶向性、特異性、應激反應小、高感染效率等優(yōu)點，可被廣泛應用于制備抗豬肺炎支原體感染以及預防相關疾病的疫苗或藥物中，生產(chǎn)方便，使用簡單。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域中的重組病毒載體及應用，特別是涉及一種攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體及其構建方法，與其在制備抗豬肺炎支原體感染及預防相關疾病的疫苗或藥物中的應用。

背景技術

豬氣喘病或豬喘氣病，又稱豬支原體肺炎，是由支原體科豬肺炎支原體引起的一種接觸性、慢性、消耗性呼吸道傳染疾病。患有該病的病豬多表現(xiàn)為食欲不振，致使飼料整體利用率降低，減緩豬的生長速度，不僅延長了育肥飼養(yǎng)期，還增加了飼養(yǎng)成本，對養(yǎng)殖場來說利益受到了嚴重損害。但豬氣喘病的潛伏期較長，大多數(shù)豬在感染該病后不會表現(xiàn)出特別明顯的癥狀，很難被及時發(fā)現(xiàn)，因此整個豬群受到感染的容易度較高。

豬支原體肺炎具有發(fā)病率高、致死率低的特點，屬于慢性疾病的范疇，雖然危害性大，但對于豬個體成活率的直接影響較小，加上目前養(yǎng)殖過程中需要的烈性疾病的免疫種類已經(jīng)很多了，很多豬場管理者很難再預留出時間來接種用于預防該疾病的傳統(tǒng)疫苗，因此存在忽視該疾病的情況。因此，尋求一種使用方便且有明顯預防或治療效果的抗豬肺炎支原體感染的藥物十分緊迫。

腺相關病毒(Adeno-AssociatedVirus，AAV)屬于微小病毒科，依賴病毒屬，是一種非致病性的缺陷型病毒，在復制時需要其他病毒(如腺病毒)的基因產(chǎn)物參與輔助，進而表現(xiàn)出感染性。AAV的顆粒直徑在20～26nm之間，含有4.7kb大小的線狀單鏈DNA基因組，基因組的兩端為反向末端重復序列(Inverted Terminal Repeats，ITR)，包含了復制、包裝、拯救及整合的信號，中間為病毒的結構基因，包括與病毒復制有關的Rep基因和病毒包膜Cap基因。通過將外源基因導入AAV以及適當刪除部分結構基因以增大外源性基因的容量，可形成具有感染性的重組腺相關病毒(recombinant Adeno-Associated Virus，rAAV)，其能介導外源基因長期穩(wěn)定表達，具有生物安全性好、無致病性、免疫原性低、物理性質穩(wěn)定、宿主細胞范圍廣的優(yōu)點，被視為最有前途的基因治療載體之一，成為目前基因治療載體研究的熱點。

但在本行業(yè)內，目前暫未將重組5型腺相關病毒載體技術用于預防或治療豬肺炎支原體性疾病。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種實用性好的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體，通過將目的基因豬肺炎支原體P216基因插入5型腺相關病毒載體中，獲得攜帶P216基因的重組5型腺相關病毒載體rAAV5-P216，所述P216基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述rAAV5-P216采用三質粒共轉染法制備得到，所用的三質粒包括基因攜帶載體質粒、包裝質粒和輔助質粒，所述基因攜帶載體質粒是將外源基因的表達單位(通常由轉錄啟動子、目的基因和多聚腺苷酸序列組成)插入骨架質粒中，所述骨架質粒攜帶AAV的ITR序列，所述包裝質粒攜帶5型AAV的Cap基因和2型AAV的Rep基因，所述輔助質粒攜帶腺病毒的E2a、E4orf6和VA RNA基因。