[發明專利]攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202111162470.4
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN113755525A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 張大生
• 申請（專利權）人: 長沙愛科博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/64;C12N15/31;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 長沙七源專利代理事務所(普通合伙) 43214
• 代理人: 劉伊旸;周曉艷

1.一種攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體，其特征在于，是將目的基因豬肺炎支原體P216基因插入5型腺相關病毒載體中，獲得攜帶P216基因的重組5型腺相關病毒載體rAAV5-P216，所述P216基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根據權利要求1所述的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體，其特征在于，所述rAAV5-P216采用三質粒共轉染法制備得到，所用的三質粒包括基因攜帶載體質粒、包裝質粒和輔助質粒，所述基因攜帶載體質粒是將外源基因的表達單位插入骨架質粒中，所述骨架質粒攜帶AAV的ITR序列，所述包裝質粒攜帶5型AAV的Cap基因和2型AAV的Rep基因，所述輔助質粒攜帶腺病毒的E2a、E4orf6和VARNA基因。

3.根據權利要求2所述的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體，其特征在于，所述骨架質粒為pAAV-MCS、pAAV-IRES-hrGFP或pAAV-CAG-RFP；所述包裝質粒為pAAV-RC5，所述輔助質粒為pHelper。

4.一種如權利要求3所述的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、將豬肺炎支原體P216基因插入骨架質粒中，形成攜帶P216基因的重組腺相關病毒DNA載體質粒；

步驟2、將重組腺相關病毒DNA載體質粒、包裝質粒和輔助質粒共轉染宿主細胞，在宿主細胞中，包裝質粒提供AAV的Rep蛋白和Cap蛋白，Rep蛋白配合輔助質粒將含有外源基因表達單位的rAAV基因組從DNA載體質粒上表達出來，并加以復制，Cap蛋白將單鏈的rAAVDNA包裝成感染性的復制缺陷型病毒顆粒。

5.根據權利要求4所述的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體的構建方法，其特征在于，所述宿主細胞為Hek293細胞、HeLa細胞或PAM細胞。

6.根據權利要求4所述的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體的構建方法，其特征在于，所述步驟1的過程為：對從豬體內提取出的DNA進行PCR擴增，篩選出含有目的基因的片段并與骨架質粒進行雙酶切反應，連接后轉化到感受態細胞中，測序正確的PCR陽性克隆即為重組腺相關病毒DNA載體質粒。

7.根據權利要求6所述的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體的構建方法，其特征在于，PCR擴增時所用的引物針對P216基因進行設計，其中，正向引物為5’-CGT AGA TCT CCA CCA TGG TCT CAA CTT TTG GTT CAA TAA TC-3’，反向引物為5’-CGCACC GGT CTA AAA AGT TT CGG GCT TAA TA-3’。

8.一種抗豬肺炎支原體感染以及由肺炎支原體感染導致的疾病的疫苗或藥物，其特征在于，所述疫苗或藥物中的活性成分包括如權利要求1-3中任意一項所述的攜帶豬肺炎支原體P216基因的重組5型腺相關病毒載體。

9.根據權利要求8所述的抗豬肺炎支原體感染以及由肺炎支原體感染導致的疾病的疫苗或藥物，其特征在于，劑型為粉劑、片劑或針劑。