[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細(xì)胞表位構(gòu)建和用途

在審

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• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN113999314A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李基棕;李彬;李榮海;周金柱;趙淑慶;張寶太;鐘純燕
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇馬陵山畜禽生態(tài)養(yǎng)殖有限公司;江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C07K1/22;C12N15/62;C12N15/70;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 石家莊中和昇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 13145
• 代理人: 付會(huì)平

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，且公開了一種誘導(dǎo)豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細(xì)胞表位構(gòu)建，包括一下步驟：S1：序列合成和克?。籗2：重組蛋白HBcAg?PEDV S1的原核表達(dá)；S3：重組蛋白HBcAg?PEDV S1的純化；S4：SDS PAGE鑒定重組蛋白HBcAg?PEDV S1，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細(xì)胞表位構(gòu)建和用途，基于B細(xì)胞表位可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體，運(yùn)用HBcAg為載體，嵌合PEDV B細(xì)胞表位，用大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，透射電鏡檢測到病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。制備的疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的熒光抗體和中和抗體。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種誘導(dǎo)豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細(xì)胞表位構(gòu)建和用途。

背景技術(shù)

PEDV能感染各種年齡階段的豬，但尤以哺乳仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重，發(fā)病豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水等癥狀，死亡率高達(dá)80％以上，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種是預(yù)防PEDV感染的重要手段，目前在國內(nèi)豬場使用的減毒活疫苗和滅活疫苗均不能有效阻止病毒的感染和傳播。因此，急需開發(fā)PEDV新型疫苗。

病毒樣顆粒(VLPs)保留了病毒顆粒的天然構(gòu)象，能高密度的展示抗原表位，有更強(qiáng)的免疫原性和安全性，已成為新型疫苗的研究方向之一。近年來，豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、兔出血癥病毒和水貂腸炎病毒等VLPs疫苗均已成功上市。隨著VLPs技術(shù)的深入發(fā)展，HBcAg、腺病毒和HIVgag蛋白載體的VLPs已成為其他病原疫苗研發(fā)平臺(tái)。HBcAg具有高度的免疫原性，能自組裝成一個(gè)均勻?qū)ΨQ的二十面體，可在大腸桿菌、酵母和昆蟲細(xì)胞等多種宿主進(jìn)行表達(dá)。HBcAg的N端、C端和免疫顯性區(qū)(MIR)有很多既有高免疫原性又可進(jìn)行氨基酸替換的位點(diǎn)，可供外源表位基因插入。HBcAg載體平臺(tái)具有以下3大優(yōu)勢：①產(chǎn)量高，②免疫原性強(qiáng)，③多個(gè)插入位點(diǎn)，④可在多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中使用，⑤工藝簡單、易純化，⑥可誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而，目前尚無基于該載體的疫苗。近年來，HBcAg展示外源抗原平臺(tái)在人用疫苗中取得了較大進(jìn)展，比如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、手足口病病毒、HIV-1、漢坦病毒和流感病毒等表位在HBcAg上能有效表達(dá)。有研究者以HBcAg為載體，融合了腸道病毒VP1和VP2抗原表位，結(jié)果雙表位疫苗誘導(dǎo)的抗體水平和中和效價(jià)高于單表位，為開發(fā)雙價(jià)、多價(jià)疫苗提供了新的思路。獸用疫苗在HBcAg載體平臺(tái)的研究尚處于起步階段，研制的傳染性法氏囊病毒、PEDV和豬繁殖與呼吸綜合征病毒表位疫苗均具有較好的免疫原性。

本發(fā)明將PEDV S蛋白的B細(xì)胞表位插入HBcAg中，大腸桿菌表達(dá)量達(dá)到1.0mg/mL以上，透射電鏡觀察到VLPs形成，制備的疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的中和抗體水平，具有成為新型候選疫苗的潛力，研制PEDV多抗原表位嵌合病毒樣顆粒疫苗，可為大腸桿菌源高效亞單位疫苗研發(fā)提供新的策略。

發(fā)明內(nèi)容

(一)解決的技術(shù)問題

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細(xì)胞表位構(gòu)建和用途，基于B細(xì)胞表位可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體，運(yùn)用HBcAg為載體，嵌合PEDV B細(xì)胞表位，用大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，透射電鏡檢測到病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。制備的疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的熒光抗體和中和抗體。

(二)技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)上述所述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種誘導(dǎo)豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細(xì)胞表位構(gòu)建，包括以下步驟：

S1：序列合成和克隆

該基因序列合成于金斯瑞生物科技有限公司，該表位氨基酸序列為748YSNIGVCK755，經(jīng)雙酶切證明合成序列正確后連接在pET-28a(+)載體上，構(gòu)建成質(zhì)粒pET-28a(+)-HBcAg-PEDV S1。

S2：重組蛋白HBcAg-PEDV S1的原核表達(dá)