[發明專利]一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建和用途

在審

• 申請號: 202111161947.7
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號: CN113999314A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 李基棕;李彬;李榮海;周金柱;趙淑慶;張寶太;鐘純燕
• 申請（專利權）人: 江蘇馬陵山畜禽生態養殖有限公司;江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C12N15/62;C12N15/70;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 石家莊中和昇知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 13145
• 代理人: 付會平

1.一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建，其特征在于，包括一下步驟：

S1：序列合成和克?。?/p>

S2：重組蛋白HBcAg-PEDV S1的原核表達；

S3：重組蛋白HBcAg-PEDV S1的純化；

S4：SDS PAGE鑒定重組蛋白HBcAg-PEDV S1。

2.根據權利要求1所述的一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建，其特征在于：所述S1：該表位氨基酸序列為748YSNIGVCK755，經雙酶切證明合成序列正確后連接在pET-28a(+)載體上，構建成質粒pET-28a(+)-HBcAg-PEDV S1。

3.根據權利要求1所述的一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建，其特征在于：所述S2：將測序鑒定正確后的重組質粒pET-28a(+)-HBcAg-PEDV S1，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，挑取單菌落至含有卡那霉素(濃度為50g/mL)的LB培養基中，37℃、220r/min搖床振蕩培養至OD值為0.6～0.8時，加入誘導劑IPTG(1mmol/L)，37℃誘導5h收樣，進行SDS-PAGE電泳檢測，隨后擴大誘導的菌液量。目的蛋白得到了高效表達，大小為29kD，與預期相符。

4.根據權利要求1所述的一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建，其特征在于：所述S3：利用鎳柱純化重組蛋白，先分別用5倍柱體積的ddH2O和20mM咪唑緩沖液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)平衡鎳柱，然后將超聲破碎離心后的上清液加入鎳柱里，此步重復一次，接著利用10倍柱體積的20mM咪唑緩沖液(50mM NaH2PO4、300mMNaCl、20mM咪唑)漂洗鎳柱，洗脫掉結合不牢固的雜蛋白，最后利用200mM咪唑緩沖液(50mMNaH2PO4、300mM NaCl、200mM咪唑)洗脫目的蛋白，以1mL/min流速洗脫柱子，每1mL洗脫目的蛋白的洗脫液儲存在一個EP管內，SDS-PAGE電泳檢測蛋白的純化效果。

5.根據權利要求1所述的一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建，其特征在于：所述S4：將純化后的HBcAg-PEDV S1蛋白進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，目的蛋白可有效純化。

6.根據權利要求1所述的一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建，其特征在于：所述B細胞表位嵌合在HBcAg中，核苷酸序列為SEQ ID NO.1：

tatagtaacataggtgtttgtaaacatcatcaccatcaccatatggacattgacccttacaaagaatttggagctactgtggagcttctcagctttttgccttctgacttctttccttctgtcaggtgtctccttgacactgcctcagctctttatagggaagccttggagtctcctgagcattgctcacctcaccatactgcactcaggcaagccattctctgctggggagaattgatgactcttgctacctgggtgggtaacaatctagaggatccatatagtaacataggtgtttgtaaagcatccagagatcttgttgttaactatgttaatactaatgtgggtttgaagatcaggcaactcttgtggtttcatatatcttgccttacttttggaagagagactgtacttgaatatttggtctcttttggagtgtggatttgtactcctccagcctatagaccaccaaatgcccctatcttgtcgactcttccagaaactactgttgtt。

7.一種誘導豬流行性腹瀉病毒中和抗體的嵌合B細胞表位構建的用途，其特征在于，包括以下步驟：

S1:透射電鏡檢測HBcAg-PEDV S1 VLP形態

取少量純化的蛋白樣品滴于銅網，2％磷鎢酸負染2min，日光燈下干燥5min，將樣品置于透射電子顯微鏡下觀察樣品形態，結果可觀察到VLPs形成；

S2:小鼠免疫驗證

選取6～8周的雌性BALB/c小鼠20只，隨機分成4組，每組5只，將重組蛋白與ISA201VG佐劑1:1(體積比)混合制備疫苗，1～4組分別免疫100μL/只(PEDV S1 100組)、200μL/只(PEDVS1 200組)重組蛋白、滅活疫苗(陽性對照)以及PBS(陰性對照)，分別于第0、14、28天進行皮下注射，于免疫后第7、21、35天通過內眥靜脈采血采集小鼠血液，收集血清存放于-20℃備用；

S3:熒光抗體檢測

用間接免疫熒光方法檢測血清中的熒光抗體水平，采血檢測發現，免疫后14d檢測到熒光抗體，隨后抗體水平逐漸增加；

S4:中和抗體檢測

將待檢血清置于56℃水浴鍋中滅活，用DMEM倍比稀釋后加入96孔板中，將稀釋PEDV病毒液稀釋到200TCID50，加入96孔板中，37℃中和1h，然后置入Vero細胞中，37℃5％CO2培養72h，觀察細胞病變情況，判定血清的中和抗體效價，結果發現，免疫后28d檢測到中和抗體，隨后中和抗體水平逐漸增加。