[發明專利]一種裂褶菌發酵物及其制備方法和用途有效
| 申請號： | 202111147608.3 | 申請日： | 2021-09-29 |
| 公開（公告）號： | CN113755544B | 公開（公告）日： | 2023-05-12 |
| 發明（設計）人： | 單玉飛;吳雅勤 | 申請（專利權）人： | 廣州恒雅生物化工有限公司 |
| 主分類號： | C12P19/04 | 分類號： | C12P19/04;C12N1/14;C08B37/00;A61K8/73;A61K31/715;A61Q19/00;A61P17/00;C12R1/645 |
| 代理公司： | 北京君有知識產權代理事務所(普通合伙) 11630 | 代理人： | 焦麗雅 |
| 地址： | 510805 廣東省廣州市花都區迎賓大道*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 裂褶菌 發酵 及其 制備 方法 用途 | ||
1.一種裂褶菌發酵物的制備方法，包括如下步驟：
（1）種子活化：取裂褶菌（
（2）種子液制備：將所述活化的斜面種子從斜面培養基接入含液體培養基的錐形瓶中，在25-30℃下以200rpm的速度攪拌，培養5天后得到發酵種子液；
（3）深層發酵：將所述發酵種子液接入含有培養基的發酵罐中進行深層發酵，其中接種量5-10重量%，靜置培養6天，得到裂褶菌的發酵菌絲體；其中所用的培養基為：葡萄糖12-18重量%、酵母粉7-8重量%、蛋白胨5-7重量%、KH2PO4?0.5-1.0重量%和MgSO4·7H2O?0.2-0.6重量%；
（4）粗多糖提?。簩⒉襟E（3）得到的所述發酵菌絲體采用膠體磨粉碎，并且加入蒸餾水形成粗多糖料液，在60-70℃下攪拌3-5小時，離心除雜，將得到的提取液濃縮至原體積的1/2至1/3，再加入無水乙醇沉淀，將沉淀用蒸餾水復溶，得到粗多糖提取液；
（5）去蛋白：將步驟（4）得到的所述粗多糖提取液酶解，然后滅活酶后離心除去變性蛋白和酶，將離心的上清液再用有機溶劑洗滌，靜置分層除去下層有機相和中間的蛋白層，重復該過程3-5次，得到去蛋白的粗多糖提取液；
（6）純化：將步驟（5）得到的所述去蛋白的粗多糖提取液使用孔徑為50-100?kDa的超濾膜過濾，收集濾液并經過真空冷凍干燥后得到初級純化產物；
（7）精制：將步驟（6）得到的所述初級純化產物再次用去離子水溶解，將所得溶液用DEAE纖維素-瓊脂糖離子交換層析柱層析，將收集的洗脫液經凝膠過濾層析，并用苯酚-硫酸法檢測多糖，經真空冷凍干燥得到精制的裂褶菌發酵物；
其中，步驟（1）中所述的裂褶菌（
其中，步驟（5）中所述的酶解所用的酶為胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的混合物，所述胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的比例為1:4，所述酶的添加量為0.02-0.05重量%；并且
其中，步驟（3）中所述的深層發酵過程依次經歷如下四個階段：
階段一為開始發酵的0-1天，發酵條件控制為攪拌速度500rpm，通氣量0.5?vvm，溫度30℃，溶氧量D0控制為40%-45%，調節pH為4.5-5的范圍；
階段二為開始發酵的1-2天，發酵條件控制為攪拌速度450rpm，通氣量1.0?vvm，溫度27℃，溶氧量D0控制為36-40%，并且檢測葡萄糖的含量，當葡萄糖含量低于10重量%時，向發酵罐中流加葡萄糖至含量為12-18重量%，調節pH為5-6的范圍；
階段三為開始發酵的3-5天，發酵條件控制為攪拌速度600rpm，通氣量1.5?vvm，溫度40℃，溶氧量D0控制為15-20%，并且檢測葡萄糖的含量，當葡萄糖含量低于12重量%時，向發酵罐中流加葡萄糖至含量為15-18重量%，同時以液體形式流加如下濃度的物質：1?mg/L的硫胺素、0.3?mg/L的甘氨酸、0.6?mg/L的L-谷氨酸、0.05?g/L的檸檬酸、0.20?mg/L的肉豆蔻烯酸、0.30?mg/L的月桂酸，調節pH為4.5-5的范圍；
階段四為開始發酵的第6天，發酵條件控制為攪拌速度為450rpm，通氣量0.5?vvm，溫度32℃，溶氧量D0控制為15-20%，調節pH為5-5.5的范圍。
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