[發明專利]一種微孔陣列芯片的數字PCR實時分析方法

在審

• 申請號: 202111145791.3
• 申請日: 2021-09-28
• 公開（公告）號: CN113846149A
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 夏江;高鵬
• 申請（專利權）人: 領航基因科技（杭州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;B01L7/00;G16B20/30;G06K9/62
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中

本發明提供了一種微孔陣列芯片的數字PCR實時分析方法，具體包括如下步驟：S1:微孔的傾斜矯正；S2:圖片的偏移矯正；S3:提取熒光值；S4:基于隨機森林計算預測CT值。本發明基于擴增過程中的熒光值的變化計算反應單元的CT值，分析反應單元的擴增不均一問題、分析反應單元的陰性陽性問題、依據CT值分析通道串擾等問題。在數字PCR分析領域具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種微孔陣列芯片的數字PCR實時分析方法。

背景技術

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)是一種體外核酸擴增系統，基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。該技術是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性—低溫退火—引物延伸」三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。

qPCR(實時熒光定量聚合酶鏈式反應)是指在PCR進行的同時，對其過程進行監測的能力(即實時)。將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。Ct值是每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。

dPCR(數字PCR)基于聚合酶鏈式反應的原理精確的測定基因拷貝數，實現對基因突變定性和定量分析。微孔陣列芯片數字PCR是將DNA或RNA樣本稀釋并分散成數萬甚至數百萬個獨立的反應單元，每個反應單元中包含(或不包含)1個或1個以上目標分子(DNA或RNA 模板)。微反應單元單層平鋪于芯片內，將芯片放入升降溫裝置，針對所有的微反應單元的靶序列進行分子模板PCR擴增，擴增過程中微反應單元的熒光強度不斷增強，完成擴增后。 CCD或者CMOS相機在光學成像系統中采集用于特定基因片段標記的熒光探針信號，依據熒光信號強弱判斷微反應單元的陽性或陰性，最終基于統計學分析(泊松分布)檢測樣本中核苷酸的濃度。數字PCR不依賴擴增曲線的循環閾值，不受擴增效率的影響，能夠直接讀出DNA分子的個數，是一種核酸分子絕對定量技術。

dPCR(數字PCR)是在反應單元完成擴增后，基于CCD相機在光學成像系統中采集熒光信號，依據熒光信號強弱判斷微反應單元的陽性或陰性，此方法無法實時觀測擴增過程中每一個反應單元的熒光值的變化。反應單元樣品的測定在各種條件上不會完全一致，會造成 PCR擴增效率的差異。擴增過程中熒光值變化數據提供了反應單元的擴增不均一的信息，改進實驗的條件。判斷反應孔的陰性和陽性時，不僅依據熒光值的強弱，而且依據不同循環熒光值變化，增加了反應孔的陰性和陽性判斷的準確性，減少了陽性反應孔的誤判。依據反應孔在擴增過程中的熒光變化值計算反應孔的CT值，通過CT值設置判斷受串擾影響的反應單元。

發明內容

本發明基于擴增過程中的熒光值的變化計算反應單元的CT值，分析反應單元的擴增不均一問題、分析反應單元的陰性陽性問題、依據CT值分析通道串擾等問題。

本發明的目的在于：

1)微孔陣列式芯片數字PCR的成像系統中，每拍攝一張芯片，濾光片、相機、芯片載臺都會發生位置的相對移動，導致不同循環次數拍攝的圖片發生相對的傾斜或者位置偏移。針對上述情況，本專利基于每一圖片的反應孔的位置信息生成橫向連接的像素帶分布圖像，如圖2。依據橫向灰度投影值選擇最佳矯正角度。