[發明專利]人誘導多能干細胞誘導分化神經細胞評價模型的構建及其評價藥物神經毒性的用途

有效

• 申請號: 202111145332.5
• 申請日: 2021-09-28
• 公開（公告）號: CN113774023B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 屈哲;耿興超;林志;田康;霍桂桃;張頔;楊艷偉;李波
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 北京乾成律信知識產權代理有限公司 11927
• 代理人: 王月春;姚志遠

本發明公開了一種用于評價候選化合物神經毒性的方法，該方法包括：(1)在候選化合物存在時培養神經元，并確定該候選化合物對于神經突生長毒性的影響；以及(2)在該候選化合物存在時培養神經元，并監測該神經元電生理活動的情況。該方法通過體外培養人類誘導多能干細胞誘導的神經干細胞，使其分化，構建體外評價藥物神經毒性的模型，檢測藥物對神經突生長、神經電生理活動的影響，從而廣泛地應用于臨床前藥物神經毒性的評價。

技術領域

本發明涉及神經生物學領域，涉及人誘導多能干細胞誘導分化神經細胞評價模型的構建方法，本發明還涉及該評價模型在評價藥物神經毒性方面的用途。

背景技術

神經毒性(Neurotoxicity，NT)是許多新藥及其先導化合物、環境化合物、農藥等常見的毒副作用，早期篩選神經毒性藥物可避免藥品研發企業后續的大量投入，以及確定是否需要進一步開展藥物的神經毒性評價工作。神經系統對許多內源性和外源性物質都十分敏感，其結構和功能的微小變化都能引起神經生物學和行為學的改變，尤其是在神經發育階段，一旦受損可能是永久性的損傷。神經系統相對復雜，涉及的毒性靶點和受體通路也較多，如今對許多藥物神經毒性作用的確切機制尚不明確。現今，經濟合作與發展組織(OECD)和國際人用藥品注冊技術要求國際協調會(ICH)關于神經毒性評價的指導原則僅限于體內實驗，主要為神經行為學觀察和組織病理學檢查，其結果主觀性強，試驗操作費時費力，并不能從毒性作用機制上解釋和評價藥物的神經毒性作用。然而單一的體外篩選模型或指標又不能完全評價神經毒物所有的毒性靶點，因此，需建立針對不同類型神經毒物的體外篩選模型，從多個特異性檢測終點綜合評價或篩選幾類神經毒物的神經毒性作用，今后可用于預測藥物的急性神經毒性和發育神經毒性。

神經干細胞由于具備可增殖性和多能分化性，分化產生三種組成中樞神經的主要細胞類型：神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，是藥物神經毒性篩選的良好工具。本發明構建了人誘導多能干細胞(Human-Induced Pluripotent Stem Cells，hiPSC)誘導神經干細胞分化神經細胞模型，用于神經毒物的體外評價研究，探索神經細胞模型各檢測終點如神經突生長、神經電生理學等指標在評價不同種類神經毒物的特異性和敏感性。

本發明通過體外培養hiPSC誘導的神經干細胞，使其分化為成熟的神經細胞，構建人源的體外評價和篩選藥物神經毒性模型，探究血清分化、無血清定向分化、神經干細胞培養密度、培養時間對神經干細胞分化的影響。采用高內涵細胞成像技術從細胞因子表達和形態學分析神經干細胞、神經元的分化，以及神經元的生長水平，采用Q-PCR技術從基因水平相對定量分析神經干細胞、神經元、星形膠質細胞特異性表達的mRNA，以及神經元、星形膠質細胞的功能性指標mRNA的定量分析，采用微電極陣列(Microelectrode Array，MEA)技術分析神經元的電生理活動，包括放電頻率、同步性和網絡震蕩。驗證hiPSC誘導的神經干細胞具有分化為功能性神經元的能力，且適用于相應的指標檢測。并將該模型用于候選藥物對神經突生長毒性，以及使用MEA技術研究候選藥物對神經電生理的影響。

hiPSC具有無限增殖、自我更新和多向分化的特征，通過不同誘導因子的作用可定向分化為具有不同生理功能的細胞系，在神經毒性早期篩選中采用人源細胞能夠避免種屬差異，其篩選結果更接近于對人體的神經毒性作用。

本發明的研究結果表明探索神經毒性體外篩選模型及生物學指標的應用范圍，可為不同種類神經毒物的早期篩選或評價提供快速、有效的方法，并有利于方法學之間的比較研究和驗證，多種體外檢測指標的綜合測試和組合應用也為藥品監管科學提供了新方法和新思路。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種神經毒物體外篩選模型，評價各檢測終點的敏感性和特異性，并用于各類型神經毒物的篩選，為監管機構提供神經毒性體外評價策略，以解決現有體內評價方法的局限性，從候選藥物對神經突生長毒性和神經電生理的影響綜合評價神經毒物的多靶點毒性。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種用于評價候選化合物神經毒性的方法，該方法包括：