[發(fā)明專(zhuān)利]人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建及其評(píng)價(jià)藥物神經(jīng)毒性的用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111145332.5
• 申請(qǐng)日: 2021-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113774023B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 屈哲;耿興超;林志;田康;霍桂桃;張頔;楊艷偉;李波
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)食品藥品檢定研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0793
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0793
• 代理公司: 北京乾成律信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11927
• 代理人: 王月春;姚志遠(yuǎn)

1.一種用于評(píng)價(jià)候選化合物神經(jīng)毒性的方法，其特征在于，所述方法由以下兩種組成：

(1)在候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)神經(jīng)元，并確定所述候選化合物對(duì)于神經(jīng)突生長(zhǎng)毒性的影響；以及

(2)在所述候選化合物存在時(shí)培養(yǎng)神經(jīng)元，并監(jiān)測(cè)所述神經(jīng)元電生理活動(dòng)的情況；

其中，在培養(yǎng)所述神經(jīng)元的過(guò)程中，不添加血清，

其中，所述神經(jīng)元來(lái)源于人神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化，所述人神經(jīng)干細(xì)胞定向分化第21天轉(zhuǎn)變成所述神經(jīng)元，

其中，所述神經(jīng)干細(xì)胞的接種濃度為1×10⁸L^-1，

其中，將所述神經(jīng)元轉(zhuǎn)移至微電極陣列板，培養(yǎng)60天直至產(chǎn)生穩(wěn)定連續(xù)的放電后，分別加入不同濃度的所述候選化合物，分別檢測(cè)給藥24h、48h和72h后的所述神經(jīng)元電生理活動(dòng)的情況，

其中，所述人神經(jīng)干細(xì)胞為人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞，所述人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源于女性皮膚成纖維細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述候選化合物選自以下的一種或多種：奧沙利鉑、苯妥英鈉、大黃素、烏頭堿、異煙肼、乙胺丁醇、金剛烷胺、丙烯酰胺和氧化鐵納米粒子。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括：在所述候選化合物不存在時(shí)培養(yǎng)所述神經(jīng)元，并與所述候選化合物存在時(shí)的所述情況相比較。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人神經(jīng)干細(xì)胞為商業(yè)化的人神經(jīng)干細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括：添加神經(jīng)干細(xì)胞維持培養(yǎng)基、神經(jīng)元定向分化維持培養(yǎng)基和神經(jīng)元接種培養(yǎng)基，將所述人神經(jīng)干細(xì)胞定向分化成所述神經(jīng)元。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述人神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化成所述神經(jīng)元的過(guò)程中，分別于所述神經(jīng)干細(xì)胞定向分化第7、14、21天，使用β-微管蛋白Ⅲ和微管相關(guān)蛋白2免疫熒光標(biāo)記所述神經(jīng)元。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述人神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化成所述神經(jīng)元的過(guò)程中，分別于所述神經(jīng)干細(xì)胞定向分化第0、7、14、21天檢測(cè)以下基因的表達(dá)情況：微管蛋白、突觸素、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、波形纖維蛋白、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和巢蛋白。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用所述微電極陣列技術(shù)監(jiān)測(cè)所述神經(jīng)元平均放電率和簇頻率均值變化的情況。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)所述神經(jīng)突生長(zhǎng)的情況。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像方法確定所述候選化合物對(duì)于所述神經(jīng)突生長(zhǎng)毒性的影響。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，在所述高內(nèi)涵細(xì)胞成像方法中，綠色熒光標(biāo)記所述神經(jīng)元和所述神經(jīng)突，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經(jīng)突生長(zhǎng)毒性的評(píng)價(jià)指標(biāo)選自以下的一種或多種：神經(jīng)突總長(zhǎng)度、最長(zhǎng)神經(jīng)軸突數(shù)、神經(jīng)突端點(diǎn)數(shù)、神經(jīng)段數(shù)、神經(jīng)根數(shù)和神經(jīng)節(jié)點(diǎn)數(shù)。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，向所述神經(jīng)元分別添加4個(gè)劑量水平的所述候選化合物，檢測(cè)所述候選化合物影響所述神經(jīng)突生長(zhǎng)的所述評(píng)價(jià)指標(biāo)的劑量效應(yīng)關(guān)系。

14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法在評(píng)價(jià)藥物神經(jīng)毒性中的用途。