[發(fā)明專利]小鼠肝炎病毒實時熒光RT-RPA檢測的引物和探針、試劑盒及檢測方法

在審

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• 申請日: 2021-09-28
• 公開（公告）號: CN113913552A
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發(fā)明（設計）人: 馬鳴瀟;費東亮;孫莉;張旭;劉坤洋;李明;閆雪;李玉海
• 申請（專利權）人: 錦州醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12N15/70;C07K14/165;C07K14/08;C12R1/93;C12R1/19
• 代理公司: 錦州遼西專利事務所(普通合伙) 21225
• 代理人: 王佳佳

一種小鼠肝炎病毒實時熒光RT?RPA檢測的引物和探針、試劑盒及檢測方法，包括上游引物、下游引物和探針，所述試劑盒用于小鼠肝炎病毒檢測，試劑盒包括上述的上游引物、下游引物、探針，還含有逆轉錄酶、結合單鏈核酸重組酶、單鏈DNA結合蛋白酶、鏈置換DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、再水化緩沖液、醋酸鎂溶液、酶擴增八聯(lián)管、陽性對照以及陽性對照。優(yōu)點是：特異性高，準確度高，并且易保存運輸，擁有良好的穩(wěn)定性，可以監(jiān)測整個檢測過程。

技術領域

本發(fā)明屬于生物核酸分子檢測技術領域，具體涉及一種應用實時熒光反轉錄后重組酶依賴擴增技術檢測(Reverse Transcript RecombinasePloymerase Amplification,RT-RPA)檢測的引物和探針及試劑盒。

背景技術

冠狀病毒科病毒是一類極為重要的致病病原體，感染的宿主范圍較廣，包括人、鳥類及多種哺乳類動物，可引起上呼吸道、胃腸道、肝臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病。鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus MHV)屬于冠狀病科冠狀病屬，不同年齡、品系和免疫狀態(tài)的小鼠均可感染，感染可引起肝炎、腦脊髓炎和腸炎等不同癥狀。但在臨床上小鼠多表現(xiàn)為隱性帶毒感染，一旦與某些微生物發(fā)生混合感染，或在某些條件的刺激下，就會發(fā)生爆發(fā)流行。鼠肝炎病毒是感染嚙齒類實驗動物各種病毒中最難清除的病毒之一。感染鼠肝炎病毒的鼠群，各種免疫應答參數(shù)會發(fā)生改變，對實驗結果產(chǎn)生各種影響，是實驗動物國家標準GB14922-2011(實驗動物微生物等級及監(jiān)測)強制規(guī)定必檢排除病原體之一。

目前，國內(nèi)鼠肝炎病毒感染的診斷方法有很多，包括病毒分離與電鏡觀察和ELISA等傳統(tǒng)方法，但這些方法即復雜又繁瑣，耗時費力、靈敏性低等，不利于鼠肝炎病毒常規(guī)監(jiān)測。美國Charles river和歐盟FELASA等實驗動物質(zhì)量檢測實驗室都推薦采用PCR技術作為實驗動物病原的檢測方法，然而PCR方法需要精確度高、操作復雜和價格昂貴的PCR儀，并且需要良好的實驗條件和熟練的技術人員，且不適合用于現(xiàn)場快速檢測，因此目前國內(nèi)檢測實驗室對核酸檢測方法的應用較少，雖然也有TR-LAMP檢測技術用于鼠肝炎病毒檢測，但TR-LAMP等溫檢測一般需要45-60min，需要較長時間完成檢測，且需要同時精確設計6條引物，難度高操作復雜。

重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase polymerase amplification RPA)，是由英國TwistDx Inc公司開發(fā)出來的一種不同于PCR的新型等溫擴增技術。該技術主要包括：在37℃恒溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下實現(xiàn)延伸。與普通PCR和熒光定量PCR相比，整個過程不需要高溫變性和低溫退火步驟，不需要昂貴的儀器，縮短了反應時間，操作簡便，可滿足現(xiàn)場應急對病原體快速診斷需求，近年來已經(jīng)成為分子診斷行業(yè)的熱點。RPA 在核酸擴增方面與PCR和其他技術一樣有效，并且在簡化實驗條件和縮短反應時間方面取得了重大突破，目前國內(nèi)外還沒有將RPA技術應用于鼠肝炎病毒檢測的報道。因此建立實時熒光RPA檢測鼠肝炎病毒的方法十分必要。

RPA作為快速檢測方法，反應靈敏，特異性敏感性高，但目前RNA病毒標準品的制備主要以RNA片段和整個病毒顆粒作為原料，但裸露的病毒片段易降解，不穩(wěn)定，全病毒顆粒仍具有毒性，安全性較低。且由于其易受環(huán)境影響，易污染產(chǎn)生假陽性，準確度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種可監(jiān)測整個檢測過程，特異性高，準確度高，并且易保存運輸，擁有良好的穩(wěn)定性的小鼠肝炎病毒實時熒光RT-RPA檢測的引物和探針、試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明的技術方案是：

第一方面，一種小鼠肝炎病毒實時熒光RT-RPA檢測的引物和探針，所述引物分為上游引物和下游引物，上游引物、下游引物和探針序列分別如下：