[發明專利]小鼠肝炎病毒實時熒光RT-RPA檢測的引物和探針、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202111139829.6
• 申請日: 2021-09-28
• 公開（公告）號: CN113913552A
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 馬鳴瀟;費東亮;孫莉;張旭;劉坤洋;李明;閆雪;李玉海
• 申請（專利權）人: 錦州醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12N15/70;C07K14/165;C07K14/08;C12R1/93;C12R1/19
• 代理公司: 錦州遼西專利事務所(普通合伙) 21225
• 代理人: 王佳佳

1.一種小鼠肝炎病毒實時熒光RT-RPA檢測的引物和探針，所述引物分為上游引物和下游引物，其特征是：

上游引物、下游引物和探針序列分別如下：

上游引物：M-MHV(82-113)-F3:5’-CTACTCTTTATTACTATCATACTACAGTTCGG-3’；

下游引物：M-MHV(317-286)-R3:5’-GTCCTGATAAACAACCTAATGCTATTAACAAA-3’；探針：

5’-AATTGCGTGTATGCGCTAAATAATGTGTATCTT_F-T-G-THF-A—

T_QTTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer-3’；

其中T_F表示連接有熒光集團的T，T_Q表示連接有淬滅集團的T，T_F和T_Q之間是THF，3’末端標記阻抑聚合酶延伸或擴增的修飾基因；所述熒光集團FAM、HEX、TET、JOE、VIC中的一種；所述淬滅集團為BHQ，即BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一種。

2.根據權利要求1所述的小鼠肝炎病毒實時熒光RT-RPA檢測的引物和探針，其特征是：

修飾后的探針序列為：

5’-AATTGCGTGTATGCGCTAAATAATGTGTATCT-FAMdT-G-THF-A-BHQ1dT-TTTCTATAGTGTTTAC-C3 Spacer-3’。

3.含有權利要求1所述的一種小鼠肝炎病毒實時熒光RT-RPA檢測引物和探針的檢測試劑盒，其特征是：所述試劑盒用于小鼠肝炎病毒檢測，試劑盒包括權利要求1所述的上游引物、下游引物、探針，以及陽性對照和陽性對照；

其中，陽性對照為標準質控品，標準質控品是將噬菌體與小鼠肝炎病毒序列如SEQ IDNo:4進行連接，并在其5’端和3’端進行修飾，插入至原核表達載體pet28b中，構建重組質粒pet28b-MS2-M轉化至BL21宿主菌中，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達，形成含小鼠肝炎病病毒M片段RNA的MS2噬菌體樣假病毒顆粒。

4.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征是：所述試劑盒還含有逆轉錄酶、結合單鏈核酸重組酶、單鏈DNA結合蛋白酶(SSB)、鏈置換DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、再水化緩沖液、醋酸鎂溶液、酶擴增八聯管中至少一種。

5.一種實時熒光RT-RPA檢測小鼠肝炎病毒的方法，其特征是：

該方法為非疾病的診斷和治療方法；

包括以下步驟：

1)提取檢測樣本RNA；

2)配制含有所述引物和探針的RT-RPA反應體系，向反應體系中加入上述提取的總RNA，進行反轉錄和RPA擴增反應；

3)分析擴增產物

反應體系總體積為50μL，其中，再水化緩沖液29.2μL-30μL、Uvs X 120ng、Uvs Y 60ng、聚合酶Bsu 30ng/μL、單鏈DNA結合蛋白酶(SSB)600ng/μL、濃度為10μM上游引物1.0μL-2.4μL、濃度為10μM的下游引物1.0μL-2.4μL、10μM探針0.6μL，模板2μL、濃度為280mM的醋酸鎂2.5μL，去離子水補齊至50μL，并加入啟動反應；

RT-RPA擴增條件為：35℃-41℃，20min-30min；

步驟3)包括：根據是否出現擴增曲線，分析待檢樣本中是否含有小鼠肝炎病毒；如果有相應的擴增曲線表示待測樣本含有小鼠肝炎病毒，結果為陽性，如果沒有擴增曲線或擴增曲線低于檢測閾值表示待測樣本中未檢測到小鼠肝炎病毒，結果為陰性。

6.根據權利要求5所述的實時熒光RT-RPA檢測小鼠肝炎病毒的方法，其特征是：所述再水化緩沖液成分為：pH7.9的Tris-HCl溶液50mM，醋酸鉀100mM；dNTPs 200μM，肌酸激酶100ng/μL，二硫蘇糖醇2mM，磷酸肌酸50mM，ATP 3mM，PEG35K占再水化緩沖液體積的5％。