[發明專利]靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及構建AS疾病小鼠模型的方法

在審

• 申請號: 202111139420.4
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113755498A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 姜偉;劉玉;孔珊珊
• 申請（專利權）人: 賽業（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/89;C12N15/52;A01K67/027
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙) 32267
• 代理人: 石磊

本發明屬分子生物學領域，具體公開了一組靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及構建AS疾病小鼠模型的方法；本發明設計了特異性靶向Ube3a基因的2條gRNA，利用cas9蛋白將Ube3a基因的Exon6敲除，所敲區域序列為非3倍數，造成移碼突變，且敲除區域包含該基因編碼區的47.7%，從而達到將該基因敲除的目的，使用CRISPR/Cas9系統構建Ube3a基因敲除小鼠模型方法簡單易行，周期短，拿到陽性小鼠的概率高，利用該小鼠模型可以充分研究該疾病的致病機理，并為進一步開發針對該疾病的治療方式提供服務。

技術領域

本發明屬分子生物學領域，具體公開了一組靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及構建AS疾病小鼠模型的方法。

背景技術

Angelman綜合征(AS)又稱天使綜合征又被稱之為快樂木偶綜合征，是一種罕見的神經發育性遺傳疾病，全球發病率約為1/15000。2018年，AS被收錄于我國的《第一批罕見病目錄》中。該癥會導致發育障礙、神經系統障礙，有時還會導致癲癇。患者的預期壽命雖然跟常人一樣，但不能治愈，目前主要的治療手段包括使用抗癲癇藥物、控制癲癇發作，對于孩子的運動和語言發育遲緩進行康復訓練，這些天使綜合征的患者通常無法生活自理，需要終生被照顧。

AS發病機制是由于來自母親的第15號染色體的印跡基因Ube3a功能缺失導致的。Ube3a基因編碼E3泛素蛋白連接酶，是泛素蛋白降解系統的一部分，該基因在1997年被發現與AS有關。目前已明確4種遺傳機制可以導致AS，包括基因缺失、UBE3A突變、印跡中心缺陷和父源15號染色體存在單親二體。其中缺失情況最常見，發生在母親的Ube3a拷貝缺失，涉及染色體15q11.2-q13，占 AS病例的70％左右。其次是Ube3a突變，占病例的11％，突變導致基因表達受影響。第三是從母親遺傳的第15條染色體的印跡中心缺陷，導致基因功能異常，約占病例的6％。此外，父源15號染色體存在單親二體(UPD)，病例有兩個15 號染色體均來自父親，由于來自父親的UBE3A沉默或關閉，母親的Ube3a缺失，大腦無法從Ube3a獲得所需的信息，導致疾病發生。目前，雖然Ube3a基因突變對于AS的致病作用已經明確，但具體的分子機制尚需深入研究。所以，為了研究該疾病的發病機制以及開發有效的治療方法，構建該疾病的實驗模型對于疾病的研究不可或缺。目前小鼠模型是目前公認到的制備人類疾病模型及研究基因組功能最有效的疾病模型。但是還缺乏高效的建立AS疾病小鼠模型的方法。

發明內容

針對現有技術不足，本發明利用CRISPR/Cas9技術快速在小鼠體內將Ube3a 基因敲除，構建AS疾病模型。CRISPR/Cas9是一種由gRNA指導，利用Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術，其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA) 通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物會引導Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA，通過人工設計crRNA和tracrRNA兩種RNA，改造成具有引導作用的gRNA，從而引導Cas9蛋白對DNA的定點切割，并產生一個平末端的雙鏈DNA缺口，進而啟動DNA損傷修復機制，主要通過非同源末端連接(Non-homologous endjoining， NHEJ)或同源重組(Homologous recombination，HR)的方式將斷裂上下游兩端的序列連接起來。Cas9蛋白若要發揮作用需要靶位點下游的一個5’-NGG-3’基序，即PAM序列，基因特異的gRNA模板序列為位于PAM序列前，同時gRNA序列避免4個以上的T結尾，GC含量最佳為30％～70％。另外在選擇gRNA時應考慮到其脫靶效應，全基因的脫靶效應需考慮脫靶位點的堿基錯配數盡量不超過5個。基于以上考慮，我們共設計了2條針對Ube3a基因的gRNA，分別靶向Exon6的5’端和3’端。

本發明包括以下技術方案：

一組靶向小鼠Ube3a基因的gRNA，其特征在于，包括2條gRNA，其核酸序列分別為：