[發(fā)明專利]靶向小鼠Ube3a基因的gRNA及構建AS疾病小鼠模型的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111139420.4
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113755498A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 姜偉;劉玉;孔珊珊
• 申請（專利權）人: 賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/89;C12N15/52;A01K67/027
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙) 32267
• 代理人: 石磊

1.一組靶向小鼠Ube3a基因的gRNA，其特征在于，包括2條gRNA，其核酸序列分別為：

gRNA1=SEQ ID NO 1=5’- TGGAAGCCATTCCATCAATGAGG -3’；

gRNA2=SEQ ID NO 2=5’- AAATTAGCCCCTTCTGTAGTTGG -3’。

2.一種小鼠Ube3a基因的基因敲除試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括如權利要求1中的一組靶向小鼠Ube3a基因的gRNA。

3.使用如權利要求1所述的一組靶向小鼠Ube3a基因的gRNA構建AS疾病小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用gRNA1、gRNA2將小鼠Ube3a基因敲除。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2靶向切割小鼠Ube3a基因的第6個外顯子的5＇端和3＇端。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2將Ube3a基因包含Exon6在內的的3913bp序列切除，包含Ube3a基因整個編碼區(qū)的47.7%，達到在細胞內敲除該基因的目的。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將Cas9 mRNA以及針對Ube3a基因合成的gRNA1和gRNA2混合后注射到培養(yǎng)于M2培養(yǎng)基中具有雙核清晰的受精卵的細胞核中；

2）注射后的受精卵培養(yǎng)在特定的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至3.5天后每15-20個囊胚移植到假孕母鼠體內，產出小鼠，即為F0小鼠；

3）仔鼠出生后5天即剪鼠尾提取DNA進行PCR擴增鑒定并送測序，若有檢測結果為陽性則表示小鼠基因敲除成功。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中的測序引物為：

PCR測序引物=SEQ ID NO 3= 5’- GAAAGAGAAAAAAAGAGGAGAAGTGG -3’。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中PCR鑒定中的引物包括：

PCR Primers1,具體為

F1=SEQ ID NO 4=5'- TTGAACTTGGCTTGCCATGCTG -3'；

R1=SEQ ID NO 5=5'- TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC -3'。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3中PCR鑒定中的引物還包括；

PCR Primers2，具體為

F2=SEQ ID NO 6=5'- CTGAAAAGCCTTAAGACTGAGC -3'；

R1=SEQ ID NO 5=5'- TAGAGGGGTTCAGTTGAAAATGATC -3'。

10.如權利要求3-9任一項所述的方法構建獲得的AS疾病模型小鼠。