[發明專利]一種耐高溫、耐高糖的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202111137904.5
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113717874B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 湯岳琴;王莉;謝采蕓;茍敏;孫照勇;夏子淵
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/113;C12N15/81;C12P7/10;C12P19/14;C12P19/02;C12R1/865
• 代理公司: 成都行之智信知識產權代理有限公司 51256
• 代理人: 宋輝

本發明公開了一種耐高溫、耐高糖的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用，所述釀酒酵母菌株SEB19保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏名稱為SEB19，其保藏號為：CGMCC?NO.22589，構建方法為：以菌株SEB4為出發菌株，利用CRISPR/Case9基因編輯技術將菌株SEB4的功能基因ASP3敲除獲得工程菌株SEB19。本發明所述菌株SEB19能夠耐高溫、耐高糖，確保纖維素的酶解和微生物發酵可以同步進行，且能夠提高乙醇產量。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種耐高溫、耐高糖的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用。

背景技術

近年來，隨著全球環境的惡化及化石能源的日益枯竭，越來越多的國家開始關注可再生清潔能源燃料乙醇的開發和利用。燃料乙醇的生產通常采用釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)進行發酵，釀酒酵母最適生長溫度為30-32℃。然而，在工業生產中，同步糖化發酵(SSF)過程存在一個重要問題，即最佳酶解溫度(45-50℃)和最佳微生物乙醇發酵溫度(25-35℃)存在較大差異，導致纖維素的酶解和微生物發酵過程難以同步進行。同時，在工業生產中隨著菌株的代謝和機械攪拌等常導致發酵體系溫度升高(時常可達35-37℃)。高溫會引起酵母細胞內各種成分的理化性質發生變化，從而影響細胞正常的生命活動。為了減少冷卻水的使用和染菌的風險，選育耐高溫釀酒酵母可實現在較為寬泛的控溫前提下保證燃料乙醇生產的穩定性，減少冷卻成本。此外，在超高濃度(VHG)發酵過程中，需要酵母能夠耐受高糖脅迫從而提高乙醇產量。

因此，構建耐高溫、耐高糖的釀酒酵母很有必要，具有一定經濟價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種耐高溫、耐高糖的釀酒酵母菌株，該菌株能夠耐高溫、耐高糖，確保纖維素的酶解和微生物發酵可以同步進行，且能夠提高乙醇產量。

此外，本發明還提供一種耐高溫、耐高糖的釀酒酵母菌株的構建方法和應用。

本發明通過下述技術方案實現：

一種耐高溫、耐高糖的釀酒酵母菌株，所述釀酒酵母菌株保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏名稱為SEB19，其保藏號為：CGMCC?NO.22589，分類命名為Saccharomyces?cerevisiae,保藏日期為2021年5月24日，保藏地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101。

本發明所述菌株SEB19具有多重耐受性，能夠耐高溫、耐高糖，確保纖維素的酶解和微生物發酵可以同步進行，且能夠提高乙醇產量，能夠適用于多種環境脅迫下物料發酵。

一種耐高溫、耐高糖的釀酒酵母菌株的構建方法，以具有良好耐受性的工業釀酒菌株SEB4為出發菌株，利用CRISPR/Case9基因編輯技術將功能基因ASP3敲除獲得工程菌株SEB19。

本發明前期基于轉錄組學的研究發現在高溫、高溫乙醇雙脅迫和高糖等多種脅迫條件下，工業釀酒酵母菌株SEB4中基因ASP3(編碼L-天冬酰胺酶II)均顯著下調。目前，僅有研究表明在酵母細胞氮饑餓期間會誘導ASP3的表達，而該基因與細胞表型之間的關系并未得到證實。本發明首次發現，敲除該基因可以顯著提高酵母的高溫、高溫乙醇和高糖等耐受性。

具體地：

出發菌株：

出發菌株SEB4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.11324。

培養基：

所用培養基如表1所示。若培養基為固體培養基，則在滅菌前加入2.0％的瓊脂粉。滅菌條件為121℃，15min。所有的抗生素均在培養基滅菌后，待冷卻至50～60℃后添加。

表1培養基組成