[發明專利]一種非洲豬瘟病毒p54阻斷ELISA抗體檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202111137839.6
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113687073B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發明（設計）人: 李鵬宇;張蕾;董春娜;李靜;于之清;宗樹成;王飛;劉新月;栗利芳;肖進;齊鵬
• 申請（專利權）人: 中牧實業股份有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳

本發明公開了一種非洲豬瘟病毒p54阻斷ELISA抗體檢測試劑盒及其應用。該試劑盒包括包括以非洲豬瘟病毒p54蛋白為包被抗原的的酶聯反應板和酶標抗體；所述酶標抗體為與非洲豬瘟病毒p54蛋白特異性結合的單克隆抗體制成的酶標抗體。本試劑盒采用非洲豬瘟病毒p54純化蛋白和與非洲豬瘟病毒p54蛋白特異性結合的單克隆抗體制備的阻斷法酶聯免疫抗體檢測試劑盒，靈敏度高、特異性強，可以有效地檢測樣品中非洲豬瘟病毒抗體的含量，與進口試劑盒符合率達95％以上，具有廣闊的市場前景和良好的經濟、社會效益。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，更具體地，本發明涉及一種非洲豬瘟p54阻斷ELISA抗體檢測試劑盒及其應用，適用于非洲豬瘟抗體的特異、快速、準確檢測。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的豬的一種急性、烈性、高度接觸傳染性疾病。非洲豬瘟在臨床癥狀上與豬瘟極為相似，以高熱、高死亡率、全身廣泛性出血、呼吸障礙以及神經功能紊亂為主要特征，病死率高達100％。我國將其列為一類動物傳染病。非洲豬瘟1921年于肯尼亞發現，2007年傳入高加索地區和俄羅斯，2014年已傳入東歐大部分國家，流行趨勢擴大，2018年，我國首例非洲豬瘟在沈陽確診并迅速蔓延，給我國養豬業造成巨大經濟損失。

非洲豬瘟病毒是一種由囊膜包裹的雙股線性DNA病毒。不同毒株基因組大小存在些許差異，長度介于170-190Kb之間，有150多個主要開放閱讀框，可編碼150～200種蛋白質，其中結構蛋白為54種。其中p54蛋白由E183L基因編碼，位于病毒粒子內層囊膜，是ASFV的主要結構蛋白，也是血清抗體的主要結合位點，具有較好的免疫原性，可作為非洲豬瘟血清學檢測的診斷抗原。

由于對ASFV的生物學特性研究不充分，目前還沒有研發出針對非洲豬瘟特別有效的疫苗，對非洲豬瘟的防控主要依賴于動物檢疫，但非洲豬瘟與豬瘟臨床癥狀極為相似且作為我國的新發病，國內相應的檢測產品尚屬于空白狀態，因此研發出一款簡便、快捷、高效的檢測試劑變得尤為重要。

酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)是市場上主流的免疫測定技術，已廣泛應用于臨床檢測，快速便捷且靈敏度高，且不需要特殊的儀器設備，可用于非洲豬瘟病毒的抗體檢測。

本發明獲得了具有較好反應原性及免疫原性的可溶性p54蛋白，以該蛋白免疫BALB/c小鼠，通過細胞融合和亞克隆篩選，獲得了一株特異性單抗；分析抗體序列，構建并表達p54特異性單抗，以避免抗體生產過程中，雜交瘤細胞抗體分泌不穩定以及腹水制備批次間存在差異的問題，能夠保證抗體供應高效、穩定；研發出基于抗非洲豬瘟病毒p54蛋白特異性單克隆抗體的阻斷ELISA抗體檢測方法，解決了間接ELISA方法特異性較差的問題，使得該試劑盒具有很好的敏感性和特異性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種敏感性高、特異性強、能夠快速、簡便地檢測非洲豬瘟病毒p54抗體的阻斷ELISA試劑盒。

該試劑盒的優點之一是使用了辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗非洲豬瘟病毒p54蛋白的單克隆抗體，提高了檢測的敏感性和特異性。

基于上述目的，本發明的非洲豬瘟病毒p54阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，包括以非洲豬瘟病毒p54蛋白為包被抗原的的酶聯反應板和酶標抗體；所述酶標抗體為與非洲豬瘟病毒p54蛋白特異性結合的單克隆抗體(1H6)制成的酶標抗體。

優選的，所述非洲豬瘟p54蛋白的序列為序列表中SEQ ID No.5序列，為密碼子優化后序列，構建入原核表達載體pET-28a，該蛋白為利用大腸桿菌原核表達系統獲得的可溶性p54純化蛋白，具有良好的特異性、敏感性及免疫原性。