[發明專利]CD3/CD28/DLL4磁珠及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202111136655.8
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113832102A
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 孟麗君;張珍琦;鄧猛猛;胡紹燕
• 申請（專利權）人: 蘇州東嶺生物技術有限公司;蘇州大學附屬兒童醫院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;H01F1/42;H01F41/00
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發明公開了一種CD3/CD28/DLL4磁珠，所述磁珠表面耦連有抗人CD3抗體、抗人CD28抗體以及重組人DLL4蛋白。還公開了其制備方法和應用。本發明的CD3/CD28/DLL4磁珠在擴增T淋巴細胞時，T淋巴細胞表面TCR能與磁珠表面交聯的抗?CD3抗體結合，提供T淋巴細胞激活的第一信號；T淋巴細胞表面的CD28能與磁珠表面交聯的抗?CD28抗體結合，提供T淋巴細胞激活的第二信號；DLL4能有效的促進CD4⁺ T細胞分化為Th1效應細胞，促進CD8⁺ T細胞分化成為細胞毒CD8₊ T效應細胞。CD3/CD28/DLL4磁珠培養產生的T細胞混合物中CD8⁺ T細胞占比超過傳統CD3/CD28磁珠擴增得到的T細胞混合物，且產生的CD8⁺ T細胞遇到抗原刺激的時候能分泌更高水平的殺傷因子。

技術領域

本發明涉及一種CD3/CD28/DLL4磁珠及其制備方法和應用，屬于生物技術領域。

背景技術

傳統化療藥治療腫瘤存在易耐藥、毒副作用嚴重的難題。免疫治療作為新興的前沿科學技術，已經在全球范圍內成功治愈了多例難治易復發、無藥可救的腫瘤患者，從而成為腫瘤治療領域的新星。T細胞免疫治療（嵌合抗原受體CAR-T、T細胞受體TCR-T等）是免疫治療中的一個重要體系，與傳統化療藥相比，其優勢表現在特異性強、副作用低、治療效果持久等方面。2017年，美國食品藥監局在全球范圍內批準了首個CAR-T用于臨床治療；2021年，中國食品藥監局也批準了國內首個CAR-T用于臨床治療。

T細胞是機體內適應性免疫系統中重要的一類免疫細胞，在清除病原體入侵和殺傷腫瘤細胞過程中發揮關鍵作用。T細胞按照標志和功能不同，主要分為CD4⁺輔助T細胞和CD8⁺細胞毒T細胞。CD4⁺輔助T細胞主要的功能是輔助其他免疫細胞的活化和功能，包括輔助CD8⁺細胞毒T細胞的活化和殺傷功能，同時自身亦可發揮部分殺傷功能。CD8⁺細胞毒T細胞是體內發揮殺傷腫瘤細胞功能的主要效應細胞。研究發現，腫瘤患者體內的T細胞均存在不同程度的損傷，表現為不能有效活化、擴增和發揮殺傷功能，因此需要將患者體內的T細胞進行改造使其重新獲得殺傷功能，如CAR-T。

T細胞在沒有遇到活化信號的時候處于靜息狀態，不進行擴增和分裂。T細胞活化需要至少2個信號同時存在，第一信號是T細胞受體TCR信號，第二信號是CD28共刺激信號。兩個信號同時存在的情況下，靜息T細胞即可被活化進入增殖分裂的狀態?；罨腡細胞在合適的培養基條件下可在10天內擴增數百倍，從而滿足臨床治療對細胞量的需求。CD3/CD28磁珠是指包被了CD3抗體和CD28抗體的功能磁珠，是目前用于體外擴增T細胞最常用的活化劑，該磁珠可同時給T細胞提供第一信號和第二信號，有效活化并擴增T細胞。CAR-T的制備流程為：①從患者體內獲得外周血，在體外分離獲得外周血單個核細胞或者總T細胞；②使用CD3/CD28磁珠活化T細胞；③在培養體系中加入嵌合抗原受體CAR的病毒顆粒，感染T細胞，使其表達CAR結構，獲得特異性殺傷腫瘤細胞的功能；④體外擴增培養T細胞，得到足夠數量；⑤制備T細胞成藥懸液，質檢，凍存。

按照分化的不同階段，T細胞可分為不同的亞群，按照分化程度的加增，分別是幼稚型T細胞、干細胞樣記憶T細胞、中央記憶型T細胞、效應記憶型T細胞和效應T細胞。T細胞發揮殺傷功能需先分化為效應T細胞，方可產生效應因子如干擾素γ等殺傷腫瘤細胞。誘導T細胞分化為不同亞群的信號稱為第三信號。在IL-12的第三信號作用下，CD8⁺ T細胞可分化成為細胞毒CD8⁺ T效應細胞，CD4⁺ T細胞可分化為Th1效應細胞，這兩種細胞均具備腫瘤殺傷作用。在其他因子如TGF-β和IL-6第三信號的作用下，CD8⁺ T細胞可分化成為調節性CD8⁺ T效應細胞，CD4⁺ T細胞可分化為調節性Treg效應細胞，這兩種細胞均具備抑制免疫殺傷的作用。因此，在不同的第三信號作用下，T細胞可產生不同的功能亞群。