[發明專利]一種基于CRISPR技術檢測甘薯病毒病的方法

在審

• 申請號: 202111136529.2
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN114015687A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 王麗梅;趙瑩
• 申請（專利權）人: 舜豐生物科技（海南）有限公司;山東舜豐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/70;C12Q1/6816;C12R1/94
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;徐迅

本發明提供了一種基于CRISPR技術檢測甘薯病毒病的方法，具體地，提供了一種基于CRISPR技術檢測甘薯褪綠矮化病毒或甘薯病毒病的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和單鏈核酸檢測器進行檢測的步驟；本發明通過對gRNA的篩選和優化，提高了檢測效率，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及核酸檢測領域，涉及一種基于CRISPR技術檢測甘薯病毒病的方法，尤其涉及基于CRISPR技術檢測甘薯褪綠矮化病毒的方法、系統和試劑盒。

背景技術

甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)屬于長線形病毒科毛形病毒屬成員。甘薯褪綠矮化病毒是危害甘薯的主要病毒之一，主要由煙粉虱傳播，特別重要的是，甘薯褪綠矮化病毒可與甘薯羽狀斑駁病毒協生共侵染甘薯引起甘薯病毒病(sweet potato virus disease，SPVD)。甘薯病毒病是甘薯上是最嚴重的病毒病害之一，通常可使甘薯減產50％-98％，甚至絕收。

甘薯褪綠矮化病毒的檢測方法主要有：目測法、指示植物檢測法、酶聯免疫吸附法、免疫電鏡法、核酸雜交法、RT-PCR法。

本發明提供了一種新型的檢測甘薯褪綠矮化病毒的方法，該方法是基于CRISPR技術，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一種特異性高、檢測靈敏度高的快速檢測方法。

發明內容

本發明提供了一種基于CRISPR技術進行甘薯褪綠矮化病毒檢測的方法、系統和試劑盒。

一方面，本發明提供了一種用于檢測甘薯褪綠矮化病毒的gRNA，所述gRNA包括與Cas蛋白結合的區域和與靶核酸雜交的導向序列，所述靶核酸為來源于甘薯褪綠矮化病毒的核酸。

本發明中，所述與CRISPR/CAS效應蛋白結合的區域又稱為同向重復序列、骨架區或spacer序列，該區域與Cas蛋白相互作用，從而結合Cas蛋白。

在一個實施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括與Cas蛋白結合的區域和與靶核酸雜交的導向序列。

在一個實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列含有17-30個堿基，并且與SEQID No.2所示的序列或其反向互補序列雜交，并且所述導向序列包含SEQ ID No.8-9任一所示的序列；優選的，所述導向序列包含SEQ ID No.8、9任一所示的序列。

在優選的實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列含有17-30個堿基，例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個堿基。

在一個實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列包含SEQ ID No.8-9任一所示的序列，并且在SEQ ID No.8-9任一所示的序列的3’端還包括1-13個堿基(優選，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個堿基)，并且，所述與靶核酸雜交的導向序列與SEQ ID No.2所示的序列或其反向互補序列雜交；優選的，所述導向序列包含SEQ ID No.8、9任一所示的序列。

在一個實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列與SEQ ID No.8-9任一所示的序列相比，在SEQ ID No.8-9任一所示的序列的3’端連續缺失1-4個堿基(例如，1、2、3、4個堿基)。

所述與SEQ ID No.2所示的序列或其反向互補序列雜交，是指上述導向序列與SEQID No.2或SEQ ID No.2的反向互補序列的連續的一段可以連續的互補配對。比如，所述與靶核酸雜交的導向序列含有30個堿基，則，導向序列的30個堿基需要與SEQ ID No.2或SEQID No.2的互補序列的連續30個堿基互補配對。

在更優選的實施方式中，所述與靶核酸雜交的導向序列如SEQ ID No.8-9任一所示。