[發明專利]一種包載靶標lncRNA Pvt1納米粒子的水凝膠及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111131120.1
• 申請日: 2021-09-26
• 公開（公告）號: CN113876691B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 王征;王琳;劉峰;戴拯;黃雷
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: A61K9/06
• 分類號: A61K9/06;A61K31/7088;A61K47/18;A61K47/28;A61K47/36;A61K47/46;A61P1/00;A61P35/00;B82Y5/00
• 代理公司: 武漢信合紅谷知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42264
• 代理人: 嚴情

1.一種包載靶標lncRNAPvt1納米粒子的水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)構建含有編碼Pvt1短發卡RNA的質粒(shPvt1)：

將構建的Pvt1短發卡RNA用T4?DNA連接酶克隆至pLKO.1-TRC載體中得到shPvt1質粒；

2)鼠源結直腸癌CT26細胞膜的制備：

將2-5×10⁸個CT26細胞經磷酸緩沖鹽溶液PBS清洗后，用含有苯甲基磺酰氟PMSF的膜蛋白提取試劑A重分散，冰浴15分鐘后，將細胞-80℃和室溫反復凍融五次，將該裂解物置于低溫離心機在4℃下離心10分鐘，收集上清以去除未破碎的細胞和細胞核，將該上清低溫離心30分鐘，去除上清，沉淀用PBS重懸即為CT26細胞膜CM，利用二喹啉甲酸蛋白質檢測試劑盒對細胞膜蛋白含量定量；

3)shPvt1-CM-D納米粒子的制備：

將(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨DOTAP和膽固醇溶入裝有三氯甲烷的圓底燒瓶中，經充分混勻后，將該燒瓶置于旋蒸儀37℃旋蒸5分鐘后得到脂質薄膜，將燒瓶中加入含有shPvt1和CT26細胞膜CM的PBS水化脂質層，經過三次反復凍融并伴隨溫和超聲處理后，反復8次經高分子膜擠壓，然后低溫離心10分鐘后，棄上清并用PBS重懸沉淀以得到shPvt1-CM-D；

4)制備氧化海藻酸鹽OA溶液：

將海藻酸鈉溶于超純水中，室溫過夜攪拌以充分溶解，隨后，向該溶液中加入高碘酸鈉溶液并室溫繼續溫和攪拌24小時，從而形成氧化海藻酸鹽OA，將該混合物裝入透析袋并在超純水中透析3天，將純化后的OA凍干后重懸于PBS備用；

5)制備HA-ADH：

將透明質酸HA粉末溶于超純水并室溫溫和攪拌12小時后加入己二酸二酰肼ADH并溫和攪拌30分鐘，隨后調節pH值至4.8，上述混合物繼續加入N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC室溫反應2小時并調節pH值至4.8，從而形成HA-ADH；將該pH值調至7.0以終止反應后，將該混合物裝入透析袋并在超純水中透析3天，將純化后的HA-ADH凍干后重懸于PBS備用；

6)將步驟3)中制得到的shPvt1-CM-D納米粒子，Oxa溶液溶于步驟4)中制得的氧化海藻酸鹽OA溶液和步驟5)中制得的HA-ADH溶液共混10秒后形成shPvt1-CM-D/Oxa@gel，經5分鐘凝膠后，將該支架置于4℃備用。

2.根據權利要求1所述的一種包載靶標lncRNAPvt1納米粒子的水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟1)構建含有編碼Pvt1短發卡RNA的質粒(shPvt1)，Pvt1短發卡RNA序列為：5’-AAGGAGTCATTGTTCCATTGT-3’。

3.根據權利要求1所述的一種包載靶標lncRNAPvt1納米粒子的水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟3)采用的高分子膜孔徑為0.2μm。

4.根據權利要求1所述的一種包載靶標lncRNAPvt1納米粒子的水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟4)的透析袋截留分子量MWCO為3.5kDa。

5.根據權利要求1所述的一種包載靶標lncRNAPvt1納米粒子的水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟5)的透析袋截留分子量MWCO為20kDa。

6.一種包載靶標lncRNAPvt1納米粒子的水凝膠，其特征在于，采用權利要求1-5任意一項所述權利要求所述的制備方法制備。

7.一種如權利要求1-5任意一項所述包載靶標lncRNAPvt1納米粒子的水凝膠的制備方法制備的水凝膠在制備抑制CRC術后復發、肝轉移和遠端瘤生長的藥物中的應用。