[發明專利]一種提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法

有效

• 申請號: 202111130761.5
• 申請日: 2021-09-26
• 公開（公告）號: CN113711920B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 袁凌云;張利婷;汪承剛;黃興學;朱世東;張金龍;侯金鋒;唐小燕;張澤根
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學;安徽省皖江蔬菜產業技術研究院有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G7/06
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 李靜

本發明提供了一種提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，步驟如下：將6?BA噴施于植株花蕾上；用酒精與HgCl₂消毒花蕾；釋放小孢子，經過濾、離心得純化小孢子；將小孢子用NLN培養基稀釋、分裝到培養皿，并添加植酸；最后，熱激處理轉至黑暗培養，待出現胚狀體，振蕩培養；將培子葉期胚狀體轉移到MS培養基上分化培養，培養條件為：4℃，14h藍紅復合光照射/天，培養14天；然后，在25℃、14h藍紅復合光照射/天條件下繼續培養成苗。本發明優點為：通過外源噴施6?BA于花蕾、小孢子培養過程中在培養基中添加植酸以及調整胚狀體再生時光譜和環境溫度，建立了一種提高不結球白菜小孢子一次成苗率的新方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法。

背景技術

不結球白菜(Brassica campestris ssp.Chinensis Makino)屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)蕓薹種白菜亞種，俗稱小白菜、青菜、油菜。不結球白菜原產中國，栽培歷史悠久，是南方人民終年喜食的大眾化主要蔬菜。

孢子是植物所產生的一種有繁殖或休眠作用的細胞，能直接發育成新個體。小孢子是高等植物雄配子體減數分裂后四分體釋放出的單核細胞。游離小孢子培養是指直接從花蕾或花藥中獲得小孢子群體進行培養的方法。由于小孢子培養較花藥培養效率高，還可排除花藥壁和絨氈層組織等體細胞的影響，因此受到育種學家的青睞。

理論上，小孢子在液體培養基中培養一段時間后，會經不同時期的胚狀體，最終形成子葉形胚狀體，此時便可轉移到固體再生培養基上進行再生植株體的培養。然而，實際上，轉移至固體再生培養基上的胚狀體也并非一定能發育成正常的再生植株體，其原因主要有以下幾方面：(1)大多數小孢子來源的胚胎可能會發生異常發育，包括在下胚軸上形成次生胚；(2)轉移到固體培養基后的胚狀體，其植株再生頻率同樣受很多因素影響，如培養基成分、水分、光質等；當培養條件不當時，植株再生困難，成苗率低。因此，若能在小孢子培養過程中，避免“胚胎發生異常發育”問題，同時找到植株再生過程中的最佳培育條件，將能有效提高胚狀體再生頻率，提高其一次成苗率。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法；其通過“調整胚狀體再生時溫度”來避免胚狀體異常發育的問題，通過“外源噴施6-BA于花蕾”、“小孢子培養過程中在培養基中添加植酸”以及“調整胚狀體再生時光譜條件”來避免培養條件不當時植株再生困難、成苗率低的問題。

本發明采用以下技術方案解決上述技術問題：

一種提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，包括如下步驟：

(1)花蕾的預處理

待不結球白菜植株現蕾后，將50～150mg/L濃度的6-BA噴施于花蕾上；6-BA噴施第二天，取花序備用；

(2)小孢子分離

選取花瓣長度/花藥長度在0.5～1之間的花蕾，用70％酒精與0.1％HgCl₂進行組合消毒，再用無菌水沖洗；接著，在B5培養基中研碎花蕾釋放出小孢子，并先后使用鋼絲網篩和細胞網篩過濾；再接著，收集濾液于離心管進行離心；離心后，用B5培養基重懸沉淀后再次離心，所得沉淀即為所需的純化小孢子；

(3)小孢子培養

將純化小孢子用NLN培養基稀釋，并調整細胞密度為1×10⁵～2×10⁵個/mL^-1；接著，將稀釋后的純化小孢子分裝到培養皿中，并添加0.01％～0.5％濃度的植酸PA；最后，在33℃下熱激處理24h后轉至25℃下黑暗培養，待出現肉眼可見的胚狀體后，置于搖床上振蕩培養；

(4)胚狀體萌發及成苗