[發明專利]一種提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法

有效

• 申請號: 202111130761.5
• 申請日: 2021-09-26
• 公開（公告）號: CN113711920B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 袁凌云;張利婷;汪承剛;黃興學;朱世東;張金龍;侯金鋒;唐小燕;張澤根
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學;安徽省皖江蔬菜產業技術研究院有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G7/06
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 李靜

1.一種提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）花蕾的預處理

待不結球白菜植株現蕾后，將50~150mg/L濃度的6-BA噴施于花蕾上；6-BA噴施第二天，取花序備用；

（2）小孢子分離

選取花瓣長度與花藥長度之比在0.5~1之間的花蕾，用70%酒精與0.1% HgCl₂進行組合消毒，再用無菌水沖洗；接著，在B5培養基中研碎花蕾釋放出小孢子，并先后使用鋼絲網篩和細胞網篩過濾；再接著，收集濾液于離心管進行離心；離心后，用B5培養基重懸沉淀后再次離心，所得沉淀即為所需的純化小孢子；

（3）小孢子培養

將純化小孢子用NLN培養基稀釋，并調整細胞密度為1×10⁵~2×10⁵個/mL；接著，將稀釋后的純化小孢子分裝到培養皿中，并添加0.01%~0.5%濃度的植酸PA；最后，在33℃下熱激處理24 h后轉至25℃下黑暗培養，待出現肉眼可見的胚狀體后，置于搖床上振蕩培養；

（4）胚狀體萌發及成苗

將培養好的子葉期胚狀體轉移到MS培養基上進行分化培養，培養條件為：4℃，14h藍紅復合光照射/天，培養14天；然后，在25℃、14h藍紅復合光照射/天的條件下繼續培養成苗；其中，藍紅復合光中，藍光與紅光的比例為1:1。

2.根據權利要求1所述的提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，選擇的花序具體為無蟲害且無裂蕾的植株主花序或一級分支的健康花序。

3.根據權利要求1所述的提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，選擇對應花序后，將其置于自封袋中并噴清水，接著置于4℃冰箱中儲存1~2天，備用。

4.根據權利要求1所述的提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，對花蕾進行組合消毒的具體方法為：先用70%酒精消毒30s，再用0.1%HgCl₂震蕩消毒6min；待組合消毒完成，再用無菌水沖洗2~3次，每次5min。

5.根據權利要求1所述的提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，待選取的花蕾完成消毒與清洗后，用玻璃棒在B5培養基中研碎花蕾釋放出小孢子，并先后使用300目鋼絲網篩和細胞網篩過濾；再接著，收集濾液于離心管中，并于1000r/min條件下離心3min；離心后，用B5培養基重懸沉淀，并將重懸液于1000r/min條件下再次離心3min，最終所得沉淀即為目標所需的純化小孢子。

6.根據權利要求1所述的提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，當小孢子的細胞密度為1×10⁵~2×10⁵個/mL時，培養基呈淡黃色。

7.根據權利要求1所述的提高不結球白菜小孢子胚狀體一次成苗率的方法，其特征在于，所述步驟（4）中，轉移到MS培養基上的子葉期胚狀體的長度為2.5~3mm。