[發明專利]一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法

在審

• 申請號: 202111129115.7
• 申請日: 2021-09-26
• 公開（公告）號: CN113866301A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 張萍;魏鋒;馬雙成;康帥;李娟;劉薇;李明華;陸兔林
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 申星宇

1.一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括以下步驟

A真菌蛋白的提取；

B對所述真菌蛋白液進行純化與酶解；

C對酶解后的所述真菌蛋白液進行UPLC-MS-MS分析，按質譜-色譜條件下的方法記錄質譜指紋圖譜；

D對所述質譜指紋圖譜進行方法學考察，驗證所建立質譜指紋圖譜方法的可行性，為下一步尋找冬蟲夏草及各發酵蟲草制劑的特征離子進而鑒別真偽提供大數據支持。

2.根據權利要求1所述一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述真菌蛋白的提取的方法包括：取樣品粉末約10mg，加入適量去離子水渦旋混勻后，離心，棄去上清液，按試劑盒法提取真菌蛋白。提取2次，合并上清液，混勻后離心，吸取上清液測定蛋白的濃度，上清液全部置于內襯離心管中，離心，棄去濾液，離心管中加0.05M NH₄HCO₃溶液適量，洗滌2次，分別離心，棄去濾液，將內襯離心管倒置反超濾離心，濾液中加0.05MNH₄HCO₃溶液稀釋至濃度為1mg/mL的溶液，混勻，待用。

3.根據權利要求1所述一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述蛋白提取液純化與酶解的方法包括：將樣品與上樣Buffer混合，加熱5min，放置室溫，每孔上樣20μL，100V通電10min將樣品跑入16％聚丙烯酰胺分離膠中純化，考馬斯亮藍染色，乙酸脫色，將藍色條帶切下并切成小塊，超純水清洗，加入10mM DTT沒過膠塊于56℃下反應，吸出液體，加入55mM碘乙酰胺液室溫下避光反應。加入0.05M NH₄HCO₃/ACN(1:1)溶液脫色至膠塊變為無色，吸取液體，真空干燥。按1:20(W/W)加入胰蛋白酶，放置使膠粒充分溶脹，加入0.05M NH₄HCO₃適量，37℃下酶解18h，加入50％ACN(含5％TFA)于膠粒中，37℃溫育1h，0.1％甲酸溶解后離心取上清液進行UPLC-MS-MS分析。

4.根據權利要求1所述一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述色譜-質譜聯用檢測的色譜條件的流動相為：A：0.1％甲酸液；B：0.1％甲酸-乙腈液；流速：300nL/min。梯度洗脫程序如下：

5.根據權利要求1所述一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法，其特征在于，在色譜-質譜聯用檢測的質譜條件采用納米電噴霧離子源(NSI)正離子監測模式，噴霧電壓2.2kV，鞘氣(N2)流速60arb(約400kPa)，掃描范圍(m/z)為350～1550，一級質譜采用Orbitrap檢測器，Orbitrap Resolution：120000，二級質譜掃描為DIA掃描，采用離子肼檢測器，二級質譜碰撞能量為35％。

6.根據權利要求1所述一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法，其特征在于，對所述質譜指紋圖譜進行方法學考察，包括(1)精密度考察：取百令膠囊內容物10mg，提取真菌蛋白液并進行純化與酶解，按質譜-色譜條件下的方法重復進樣6次，記錄質譜指紋圖譜。因本實驗建立指紋圖譜的目的是尋找各樣品的差異性特征肽成分，每個水解多肽的標識是保留時間和精確質量，故選取指紋圖譜中保留時間有代表性的7個離子(330.1976，508.2743，615.3333，577.2941，218.2128，802.4413，246.2455)提取色譜峰，計算7個離子色譜峰的保留時間和精確質量，提取離子色譜圖見圖1，結果表明，各離子色譜峰的保留時間和精確質量的RSD均小于1.0％，符合指紋圖譜技術要求。(2)重復性考察：取百令膠囊10mg，共6份，提取真菌蛋白液并進行純化與酶解，按質譜-色譜條件下的方法進樣，記錄質譜指紋圖譜。同理選取上述7個離子提取色譜峰，計算7個離子色譜峰的保留時間和精確質量。結果表明，各色譜峰的保留時間和精確質量的RSD均小于1.0％，符合指紋圖譜技術要求。(3)穩定性考察：取百令膠囊10mg，提取真菌蛋白液并進行純化與酶解，按質譜-色譜條件下的方法分別于0，2，4，8，12，24小時測定，記錄質譜指紋圖譜。選取上述7個離子提取色譜峰，結果表明，7個離子色譜峰在24小時內均可檢出，各色譜峰的保留時間和精確質量的RSD均小于1.0％，說明樣品在24小時內較為穩定，符合指紋圖譜定性鑒別的技術要求。