[發明專利]一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法

在審

• 申請號: 202111129115.7
• 申請日: 2021-09-26
• 公開（公告）號: CN113866301A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 張萍;魏鋒;馬雙成;康帥;李娟;劉薇;李明華;陸兔林
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 申星宇

本發明公開了一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法，包括真菌蛋白的提?。粚λ稣婢鞍滓哼M行純化與酶解；對酶解后的所述真菌蛋白液進行UPLC?MS分析，按質譜?色譜條件下的方法建立質譜指紋圖譜，并進行方法學考察；所述質譜指紋圖譜為進一步尋找冬蟲夏草及各發酵蟲草制劑的特征離子提供了大數據支持。本發明構建的方法具有操作簡單、靈敏度高、準確性好等優點，能從質譜的整體特征上把握各樣品真菌蛋白酶解肽的質量情況，為冬蟲夏草及各發酵蟲草菌粉和制劑的質量控制、真偽鑒別提供了新的科學方法。

技術領域

本發明屬于中藥成分鑒定技術領域，尤其涉及一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法。

背景技術

中藥成分復雜，以某一成分作為控制指標已經不適合中藥質量控制的要求。中藥指紋圖譜既可以評判中藥材的真偽與優劣也可以判斷中藥成方制劑的質量優劣及制備工藝的合理性。與單一成分作為控制指標的質量控制方法相比，指紋圖譜能夠從整體化學成分上全面反映樣品的質量，進而達到有效控制質量的目的，克服了中藥有效成分大多不明確這一劣勢。

化學計量學是一門將統計學、數學以及計算機技術的方法和原理結合應用來處理化學數據的學科，它可以對化學測量過程進行優化，并可以從所測量得到的化學數據中最大程度的提取對分析有用的化學信息，其最突出的特征是將多變量分析的方法引入到了化學研究的領域，這種思想是與中醫用藥的思想有相通之處的，因此，將化學計量學應用于中藥的研究中是可行的。指紋圖譜應用于中藥質量控制中的研究是離不開化學計量學的。將現代儀器分析的方法與化學計量學方法合理結合利用，有效提取有用信息，對于改善并提高中藥質量控制方法，推進中藥現代化進程有深遠的影響。

天然冬蟲夏草與各發酵蟲草菌粉中有相似的化學成分，如甾醇類、核苷類、蟲草多糖類、蛋白質和氨基酸類、甘露醇、硬脂酸、軟脂酸、維生素、有機酸及微量元素等。真菌蛋白作為有效成分之一，研究甚少。為考察冬蟲夏草及這些發酵蟲草菌粉及制劑的真菌蛋白特點和差異，我們在同樣的條件下分析并建立了各樣品中真菌蛋白酶解后所得多肽類成分的質譜指紋圖譜，并進行了方法學考察，為后期考察各樣品的整體質量及尋找能夠鑒別冬蟲夏草和不同發酵蟲草菌粉及制劑的特征肽段，為各發酵蟲草菌粉及制劑的質量控制建立了有效方法，同時為綜合評價各發酵蟲草菌粉及制劑的質量提供技術支持。基于上述分析，提出一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法。

發明內容

本發明提供一種真菌蛋白酶解肽指紋圖譜的建立方法。

本發明包括以下步驟：

A真菌蛋白的提取；

B對所述真菌蛋白液進行純化與酶解；

C對酶解后的所述真菌蛋白液進行UPLC-MS分析，按質譜-色譜條件下的方法記錄質譜指紋圖譜；

D對所述質譜指紋圖譜進行方法學考察，驗證所建立質譜指紋圖譜方法的可行性，為下一步尋找冬蟲夏草及各發酵蟲草制劑的特征離子進而鑒別真偽提供大數據支持。

進一步地，所述真菌蛋白的提取的方法包括：取樣品粉末約10mg，加入去離子水渦旋混勻后，離心，棄去上清液，按試劑盒法提取真菌蛋白。提取2次，合并上清液，混勻后離心，吸取上清液測定蛋白的濃度，上清液全部置于內襯離心管中，離心，棄去濾液，離心管中加0.05M NH₄HCO₃溶液適量，洗滌2次，分別離心，棄去濾液，將內襯離心管倒置反超濾離心，濾液中加0.05M NH₄HCO₃溶液稀釋至濃度為1mg/mL的溶液，混勻，待用。