[發明專利]一種丙環唑半抗原及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202111125286.2
• 申請日: 2021-09-24
• 公開（公告）號: CN113698394A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 華修德;王鳴華;李姣;丁園;陳賀
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07D405/06
• 分類號: C07D405/06;C07K14/765;C07K14/77;C07K16/44;G01N33/53;G01N33/577;G01N33/58
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本發明公開了一種丙環唑半抗原及其制備方法和應用。丙環唑半抗原采用從頭合成法，在丙環唑的苯環上連接含有4個C原子的連接臂，并在連接臂末端引入可以和載體蛋白偶聯的羧基基團。利用該半抗原制備的單克隆抗體靈敏度高，特異性強。用間接競爭酶聯免疫測定(ic?ELISA)的方法測得其靈敏度(IC₅₀)為2.33μg/L，檢測范圍(IC₁₀?IC₉₀)為0.26?21.28μg/L。該單克隆抗體與丙環唑類似物均無交叉反應(CR＜0.1％)。此外，利用該單克隆抗體制備了檢測靈敏度高、特異性強、簡便快速、成本低的丙環唑膠體金快速檢測試紙條。該試紙條可用于檢測農產品中丙環唑的殘留，其檢測限達5μg/L。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種丙環唑半抗原及其制備方法和應用。

背景技術

丙環唑是一種兼具保護和治療作用的內吸性三唑類殺菌劑，它被廣泛用于防治谷類、蔬菜、水果上白粉菌、銹菌、炭疽病菌等真菌的危害。其作用機理是通過影響真菌麥角甾醇的生物合成和抑制真菌類固醇的代謝從而抑制真菌的生長發育。此外，丙環唑作為一種植物生長調節劑具有較好的控旺壓苗作用，常被用于控制菜心、普通白菜、芥藍等葉菜的外形，促進莖葉粗壯和葉色深綠，增加產量。

丙環唑的廣泛應用引發了人類對其是否會產生健康危害的思考。許多研究報道了丙環唑的過量施用損傷實驗動物的肝臟功能，影響神經行為，內分泌調節及細胞增殖。因此，丙環唑的不合理使用引起食品中農藥殘留的超標嚴重影響人類的身體健康。

我國于2021年在國標中規定，丙環唑在農產品上最低的最大殘留限量為0.02mg/kg(菠蘿，甘蔗，黑麥等)。2005年，歐盟規定了農產品中丙環唑最低的最大殘留限量為0.05mg/kg(葉菜類等)。因此，為了保障食品安全及對外貿易的發展，建立靈敏、準確、方便、省時的丙環唑檢測方法是非常必要的。

當前，丙環唑的測定方法主要為儀器檢測法，包括氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜法及液相色譜-串聯質譜法等。儀器檢測法雖然具有高精密度和準確度的優點，但是儀器價格昂貴，需要專業技術性人員操作等缺點使其不能被廣泛應用。免疫檢測法對儀器設備及專業人員的要求低，適用于大量樣品的檢測，能夠克服儀器檢測法的不足。目前，用于免疫檢測的抗體主要為多克隆抗體和單克隆抗體，其中單克隆抗體因批次差異小、可大量制備等優點，是建立免疫檢測方法和開發免疫檢測產品的首選抗體。酶聯免疫免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)和膠體金試紙條是常用的免疫檢測方法，ELISA具有靈敏度高、準確性好、成本低等優點，且可對大量樣品進行高通量的定量檢測；試紙條具有操作簡便、快速、經濟等優點，且檢測結果呈現直觀。然而，免疫檢測法的靈敏度、特異性取決于抗體的質量，而半抗原的結構決定了是否能夠獲得高質量的抗體。因此，半抗原的結構對于免疫方法的建立起著決定性的作用。

發明內容

本發明提供了一種丙環唑半抗原及其制備和應用。

第一方面，該發明設計的丙環唑半抗原結構式如式I。

第二方面，本發明提供了一種上述丙環唑半抗原的制備方法，其制備步驟如下：

步驟1)1.52g N-溴代琥珀酰亞胺與2g 2-氯-4-溴-苯乙酮加入12mL乙腈中，在12℃的條件下攪拌反應10分鐘。隨后2.95g對甲苯磺酸加入上述混合液中，并在15-80℃的條件下攪拌反應1.17小時。反應得到的產物通過硅膠柱純化，用體積比為100∶1到10∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脫分離，得產物1。

步驟2)4g產物1與2g 1，2-戊二醇加入24mL甲苯中，然后加入12mL正丁醇和1.1g對甲苯磺酸，上述混合物在135℃下攪拌反應15h。反應結束后其產物通過硅膠柱純化，用體積比為100∶1到10∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脫分離，得產物2。