[發明專利]一種嵌合酶及其在體外一步反應合成Cap0 mRNA的用途和方法

在審

• 申請號: 202111123695.9
• 申請日: 2021-09-24
• 公開（公告）號: CN113862235A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 崔利蘭;王凡;鄒媛華;徐志豪;張靜華;鄭紫君;王明明
• 申請（專利權）人: 蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N9/10;C12N9/14;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 王秋霞;許亦琳

本發明涉及分子生物學領域，特別是一種嵌合酶及其在體外轉錄中一步合成Cap0mRNA的用途和方法，所述方法包括利用嵌合酶和體外轉錄模板混合后共反應，一步反應獲得加帽加尾的mRNA產物，所述嵌合酶包括RNA聚合酶結構域和加帽酶催化結構域，所述嵌合酶經嵌合設計具備體外轉錄和加帽的雙重功能。本發明開辟了體外酶法一步合成mRNA的方法，提高了合成效率和mRNA產率。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種嵌合酶及其在體外一步反應合成Cap0 mRNA的用途和方法。

背景技術

近年來，以呼吸道為主的傳染病嚴重威脅公眾健康，在此背景下，基于mRNA的體外轉錄技術由于在研發設計中僅需提供抗原的基因序列，而不必進行高致病性病原的分離培養，在應對高傳播風險的病毒時優勢明顯，且mRNA疫苗生產工藝簡單、合成快速、成本較低，提供天然抗原表位，所以成為一種極具優勢的新型疫苗。

mRNA的體外轉錄體系的工作原理是以DNA為模板，在一系列轉錄因子的作用下，經過RNA聚合酶合成RNA。轉錄反應中合成的加帽RNA可以用于體外翻譯、轉染等試驗。常用的聚合酶為噬菌體來源的RNA聚合酶，如T7、SP6、T3等，其中T7 RNA聚合酶(T7 RNAPolymerase)是一種高度特異識別T7啟動子序列的DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動子下游NTP的摻入，合成與T7啟動子下游的模板DNA互補的RNA。由于轉錄得到的RNA是不穩定的，因此需要對RNA進行加工修飾，包括5’端形成帽子結構，3’端添加poly(A)尾巴結構，起到穩定RNA、防止降解、幫助翻譯等作用。體外mRNA加帽有兩種常用方法，第一種是在mRNA轉錄系統中添加一個規則的m7GpppG帽類似物結構或者抗反向帽類似物(ARCA)來實現mRNA加帽及體外轉錄。第二種是在體外轉錄初期，通過加帽酶反應完成mRNA加帽，牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結構的有效酶，其由D1和D12兩個亞基組成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥苷酰基轉移酶活性和鳥嘌呤甲基轉移酶活性，可將7-甲基鳥嘌呤帽結構(m7Gppp)連接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。

目前，市場上的體外轉錄試劑盒主要是針對以上兩種方法開發的，第一種依靠帽類似物在轉錄過程中產生帽子結構的方法，效率不高，產率較低，產生的轉錄產物的免疫原性較高，對后續轉錄產物mRNA的應用造成困難。第二種利用加帽酶對RNA的5’端添加帽子結構，此類產品也是在獲得體外轉錄的RNA基礎上，對產物進行加帽，這樣的方法從轉錄、加帽到加尾涉及多次加酶操作，耗時較長，程序繁瑣，流轉的過程也會造成中間產物的降解和損失，整體的效率和產率都有待提升。

針對上述市場產品存在的技術問題，尤其是針對轉錄加帽如何同步工作，同時能夠產生高質量轉錄產物的問題，許多專業人員都進行了相關改造和探索，比如在利用原核系統中的相關轉錄工具酶制備mRNA，選擇將原核細胞裂解以后獲得其中的RNA聚合酶和加帽酶，但是該法的裂解產物為原核細胞中的所有酶類，其中不乏大腸內源其他雜質核酸酶或核酸，這樣會導致酶系統的特異性不高，降低后續的mRNA的生成效率、質量和產量。甚至會直接將RNA降解，無法有效轉錄目的片段。

所以目前缺乏工藝簡便、流程較短的規模化量產的mRNA生產技術，建立這樣一套操作簡便、穩定性好、高效的mRNA制備方法將推動mRNA疫苗平臺，助力未來的疫苗研發進程。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種嵌合酶及體外一步反應合成Cap0 mRNA的方法，用于解決現有技術中的問題。