[發(fā)明專利]一種嵌合酶及其在體外一步反應(yīng)合成Cap0 mRNA的用途和方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202111123695.9 | 申請(qǐng)日： | 2021-09-24 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN113862235A | 公開(kāi)（公告）日： | 2021-12-31 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 崔利蘭;王凡;鄒媛華;徐志豪;張靜華;鄭紫君;王明明 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N9/12 | 分類號(hào)： | C12N9/12;C12N9/10;C12N9/14;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/10;C12R1/19 |
| 代理公司： | 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219 | 代理人： | 王秋霞;許亦琳 |
| 地址： | 215200 江蘇省蘇*** | 國(guó)省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 嵌合 及其 體外 一步 反應(yīng) 合成 cap0 mrna 用途 方法 | ||
1.一種用于體外酶法一步合成mRNA的嵌合酶，所述嵌合酶為轉(zhuǎn)錄加帽嵌合酶，其特征在于，所述嵌合酶包含加帽酶結(jié)構(gòu)域和RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域，所述RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域包括RNA聚合酶和Spy Catcher，所述加帽酶催化結(jié)構(gòu)域包括病毒加帽酶和Spy Tag；或，所述RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域包括RNA聚合酶和Spy Tag，所述加帽酶催化結(jié)構(gòu)域包括病毒加帽酶和SpyCatcher；所述嵌合酶中Spy Tag和Spy Catcher共價(jià)結(jié)合；所述RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域和加帽酶催化結(jié)構(gòu)域中均還包括蛋白純化標(biāo)簽。
2.權(quán)利要求1所述的嵌合酶在體外轉(zhuǎn)錄中一步合成mRNA的應(yīng)用。
3.一種體外轉(zhuǎn)錄一步合成mRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：①獲得mRNA轉(zhuǎn)錄的模板DNA；②加入權(quán)利要求1所述的嵌合酶共反應(yīng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄一步獲得具有Cap0帽子結(jié)構(gòu)的mRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，還包括以下特征中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)：
1)所述模板DNA選自質(zhì)粒DNA或分離的目的DNA片段；
2)所述方法還包括將緩沖液加入到嵌合酶與模板DNA的共反應(yīng)體系中；
3)所述方法還包括將dNTP加入到嵌合酶與模板DNA的共反應(yīng)體系中；
4)所述方法還包括將甲基化供體試劑加入到嵌合酶與模板DNA的共反應(yīng)體系中；
5)共反應(yīng)條件為35℃～38℃反應(yīng)2-3小時(shí)；
6)所述方法還包括將共反應(yīng)獲得的具有Cap0帽子結(jié)構(gòu)的mRNA進(jìn)行純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述質(zhì)粒DNA中包括目的DNA和載體，所述載體中包括T7啟動(dòng)子、5'和3'UTR以及PolyA尾元件。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒DNA為可線性化的質(zhì)粒DNA，所述可線性化的質(zhì)粒DNA的載體的序列如SEQ ID NO:13所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶中RNA聚合酶為噬菌體來(lái)源的RNA聚合酶、原核生物的RNA聚合酶、真核生物的RNA聚合酶或在線粒體及葉綠體中的RNA聚合酶；
和/或，
所述嵌合酶中病毒加帽酶選自以下中的一種或多種：牛痘病毒加帽酶、藍(lán)舌病毒加帽酶、竹花葉病毒加帽酶、非洲豬瘟病毒加帽酶、1型有機(jī)湖藻DNA病毒加帽酶、2型有機(jī)湖藻DNA病毒加帽酶、球形綜囊藻病毒加帽酶或金色藻病毒加帽酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述噬菌體來(lái)源的RNA聚合酶選自T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶中RNA聚合酶通過(guò)第一連接肽和Spy Catcher連接，和/或，所述病毒加帽酶通過(guò)第二連接肽和Spy Tag連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶為T7 RNA聚合酶-牛痘病毒加帽酶嵌合酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶中RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域和加帽酶催化結(jié)構(gòu)域中均還包括蛋白純化標(biāo)簽；優(yōu)選的，所述蛋白純化標(biāo)簽選自HIS-Tag、GST-Tag、MBP-Tag、NusA-Tag或SUMO。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述嵌合酶的氨基酸序列包括如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
13.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的嵌合酶，或編碼所述RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域，或編碼所述加帽酶催化結(jié)構(gòu)域。
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