[發明專利]一種新型冠狀病毒多肽高效偶聯技術及其應用

在審

• 申請號: 202111119260.7
• 申請日: 2021-09-24
• 公開（公告）號: CN113721016A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 陳澤良;易懷敏;陸家海;張力華
• 申請（專利權）人: 深圳藍韻生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/532;G01N21/76
• 代理公司: 深圳至誠化育知識產權代理事務所(普通合伙) 44728
• 代理人: 劉英

1.一種新型冠狀病毒多肽高效偶聯技術，其特征在于：包括間接ELISA法，所述間接ELISA法包括以下操作步驟：

S1：采用間接ELISA法，血清樣品中的SARS-CoV-2抗體與固定在ELISA板的SARS-CoV-2抗原物質結合，洗滌除去非結合的抗原及雜質，再加入酶標二抗。通過加入與酶反應的底物后顯色，根據酶標儀OD450值可以判斷樣品中抗體的含量；

S2：相關試劑配制；

a1：封閉液，優選0.5％BSA的PBS液，0.22μm濾器過濾除菌，保存于4℃；

a2：洗滌液PBST，優選0.5％Tween20，PBS液，震蕩混勻，室溫保存；

a3：0.05mMCBBuffer，4.77gNa2CO3+8.82gNaHCO3，加入2L雙蒸水充分攪拌；

a4：鏈霉親和素包被酶標板，5μg/mL鏈霉親和素加入微孔板，4℃孵育12h，取出微孔板，PBST液洗滌三次，加100μl/孔封閉液，置于37℃震蕩孵育1h，隨后用PBST液洗滌3次，即得到鏈霉親和素包被的酶標板；

a5：辣根過氧化物酶HRP標記鼠抗人IgG單克隆抗體，HRP活化，稱取2mgHRP溶解于500μl雙蒸水，于上清液中加入0.5ml現配的0.06M過碘酸鈉溶液，4℃避光反應30min；然后加入160MM的乙二醇溶液0.5ml，室溫放置30min，上液中加2mg抗體，混勻后裝入透析袋中，置于0.05mMCBBuffer中，4℃攪拌過夜透析，將透析后液體吸出至15ml離心管，加入0.2ml新配制的5mg/mlNaBH4，置于4℃2h，加入等量飽和硫酸銨溶液，混勻后置于4℃30min后，4℃、4000r離心20min，棄上清，將沉淀溶于PBS溶液中，裝入透析袋，放入0.05mMCBBuffer透析液中，4℃攪拌過夜，中途更換透析液一次，透析完成后，將液體吸出，4℃、12000r離心20min，取上清和等量甘油混勻，-20℃保存，HRP單克隆抗體混合比例為1:1，可將HRP標記的鼠抗人IgG抗體進行一定倍數的稀釋(100μl/孔)，37℃孵育30min，PBST洗滌5次。

2.根據權利要求1所述的一種新型冠狀病毒多肽高效偶聯技術，其特征在于：還包括磁微?；瘜W發光法，所述磁微?；瘜W發光法包括以下操作步驟：

T1：包被在磁微粒上的新型冠狀病毒抗原與樣本中的特異性IgG抗體結合，洗滌后加入吖啶酯標記的鼠抗人IgG抗體，形成免疫復合物，加入底物液，發生化學發光反應，產生的發光信號值與樣本中特異性IgG抗體的含量呈正相關；

T2：相關試劑配制；

b1：鏈霉親和素SA包被磁微粒，用4℃的MES溶液(0.1M，pH＝6.0)分別配制5mg/ml的EDC和NHS溶液，取10mg羧基修飾磁珠(所述的磁珠粒徑為0.1-5μm)，分別加入等體積的上述EDC和NHS溶液，置于垂直旋轉混勻儀上保持磁珠懸浮，37℃活化45min，磁分離器回收磁珠，PBS液(0.02mol/L，pH8.0)洗滌3次后重懸；取活化后的磁珠與適量鏈霉親和素進行偶聯，每1mg磁珠中添加100mgSA進行偶聯，37℃活化1h，磁分離器回收磁珠；加入PBS(優選含1％的BSA)溶液重懸磁珠，37℃封閉45min(30min-1h)；PBS溶液洗滌磁珠3次，用PBST(含0.1％Tween20)保存緩沖液重懸，4℃保存；

b2：Biotin-RBD抗原的制備，同上述間接ELISA法步驟；

b3：Biotin-RBD抗原包被在SA磁微粒上，取100μlSA磁微粒懸浮液，加1mlBufferⅡ緩沖液重懸(PBSpH＝7.4，含0.05％的Tween-20，可根據需要添加0.01％～0.1％BSA)，磁吸附去上清；加1mlBufferⅡ稀釋的Biotin-RBD抗原(使磁珠濃度為1mg/ml)，室溫下旋轉混勻反應60min，磁分離去上清，BufferⅡ洗滌3次；加適量BufferⅡ緩沖液，重懸至工作濃度，即得到Biotin-RBD抗原包被的SA磁微粒；

b4：吖啶酯標記鼠抗人IgG抗體的制備，采用0.02MPBS緩沖液對鼠抗人IgG抗體進行透析，吸取lmg透析后的鼠抗人IgG抗體于適當容器中，以PBS稀釋；吖啶酯標記前先在無水N，N-二甲基甲酞胺中溶解成0.1～100mg/ml的吖啶酯母液，鼠抗人IgG抗體和吖啶酯母液按摩爾濃度1:100比例標記，立即渦旋混勻，避光條件下，室溫置血液混勻儀上反應1h；加入l0mg/ml的賴氨酸溶液335μl，立即渦旋混勻，避光條件下，室溫在血液混勻反應l0min；反應完成后過脫鹽柱，得到吖啶酯標記的鼠抗人IgG抗體；采用方陣滴定法確定吖啶酯標記鼠抗人IgG抗體的最適工作濃度，用PBS進行稀釋，混勻即可，置2-8℃存放。