[發(fā)明專利]單核細胞增生李斯特菌P60單克隆抗體及免疫磁珠和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111116748.4
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN115851609A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設計）人: 賈燕濤;王莉;張明陽;錢韋;王娟;武瑤
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/543;C12R1/91
• 代理公司: 北京潤平知識產(chǎn)權代理有限公司 11283
• 代理人: 嚴政

本發(fā)明涉及生物技術領域，公開了單核細胞增生李斯特菌P60單克隆抗體及免疫磁珠和用途。單核細胞增生李斯特菌P60蛋白雜交瘤細胞株12A5H5F8，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.23021，產(chǎn)生的單克隆抗體和納米磁珠偶聯(lián)得到了單核細胞增生李斯特菌P60單克隆抗體免疫磁珠。單核細胞增生李斯特菌P60蛋白雜交瘤細胞株12A5H5F8，可以產(chǎn)生可以特異性識別LM分泌的P60蛋白的單克隆抗體，由該單克隆抗體制備的免疫磁珠可以特異性的捕獲LM，而且對食品和環(huán)境中痕量細菌有很高的靈敏性，具有特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及單核細胞增生李斯特菌P60單克隆抗體及免疫磁珠和用途。

背景技術

食品安全與人們的日常生活以及身體健康息息相關，近年來隨著人們生活水平的提高，進口冷凍冷藏生肉、冰鮮水產(chǎn)品、乳粉等越來越多，但質(zhì)監(jiān)部門不斷從這些產(chǎn)品中檢測出多種致病微生物，例如從蝦蟹貝類中檢出相對較高的副溶血性弧菌，檢出率高達26.92％，從13.35％的豬肉和7.87％的魚類中檢測出單增李斯特菌，這些都提醒我們發(fā)展食源性致病菌快速檢測技術刻不容緩。

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是危害最大的食源性致病菌之一，占人類李斯特菌病的95％以上。LM是一種機會性病原菌，能迅速感染并擴散到宿主血液系統(tǒng)，導致腦膜炎、敗血癥或流產(chǎn)等嚴重疾病，在免疫功能低下人群、老年人、兒童和孕婦等高危人群中尤其危險，而食用受污染的食品(乳制品，生肉和蔬菜)仍然是造成感染的主要原因。鑒定活菌細胞和評估食品微生物質(zhì)量的“金標準”是平板計數(shù)法，這種方法分析時間長，無法滿足當前食品行業(yè)對快速和高通量技術的需求?，F(xiàn)在，基于分子生物學的PCR技術，免疫學的ELISA方法等已成為快速檢測的替代方法。另外，病原菌的全基因組測序(WGS)也已成為調(diào)查食源性疾病暴發(fā)的重要工具，一些國家已將WGS納入國家食品控制系統(tǒng)。

免疫磁珠分離技術(Immunomagnetic separation，IMS)是利用抗原抗體特異性結合的特點，以磁性微球為載體偶聯(lián)抗體，抗原抗體反應后，在定向磁場的作用下快速分離并富集抗原的技術。IMS可以提升上游目的抗原(如致病菌、細胞因子等)的濃度，降低原有檢測方法的檢測限，提高檢測方法的靈敏度，可以與傳統(tǒng)平板計數(shù)、免疫檢測、生化技術等結合，是食品中LM檢測的有效輔助手段。IMS開發(fā)的重點是區(qū)分樣品中LM和其它病原菌或者非致病性李斯特菌，提高LM富集的敏感性和選擇性。為了實現(xiàn)更特異的檢測，與細菌致病性相關的主要毒力因子：李斯特菌溶血素O(LLO)和P60蛋白，是首選的LM檢測靶標。P60蛋白是LM細胞表面特異性的蛋白，在宿主入侵、細胞分裂和繁殖中起著重要作用，除此之外，P60蛋白還可以大量分泌到生長介質(zhì)中。這些特性使P60成為開發(fā)免疫檢測系統(tǒng)的理想靶點。

關于LM中P60蛋白及其抗體的應用包括：ELISA和免疫熒光，例如CN104178458A、CN105527441A、DE4318450A1、JP2006104154A、US2006078951A1、KR100504132B1、KR1020040088597A、US5932415A；膠體金試紙條，例如CN103911347 A、CN202710560 U、CN201548546 U、CN101609095A、CN101561436A、CN106093410A、EP0576842A2、JPH06233699A；基于生物素化P60蛋白單抗的A-BELISA檢測和定量方法，例如CN104099299A；疫苗制備，例如CN101698100A、CA2817495A1、EP1708741B1、KR20090092803A、US9605251B2；癌癥治療，例如CN110913911A、WO2011060093 A3；重組核酸分子和表達試劑盒，例如CN1921884A、JP2007518405A、JP2007518405A、US20090081725A1；RNA藥物組合物，例如CN108778308A、EP3319622A1、US20100172976 A1。