[發(fā)明專利]高效同源重組的擬無(wú)枝酸菌工程菌株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111116446.7
• 申請(qǐng)日: 2021-09-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113717914B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟永宏;強(qiáng)珊;郭建琦;牛永潔;楊璐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西海斯夫生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12N15/31;C12N13/00;C12N15/01;C12P7/24;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

1.ku1基因缺失在提高擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.) 的同源重組效率中的應(yīng)用，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.ku2基因缺失在提高擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.) 的同源重組效率中的應(yīng)用，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.高效同源重組的擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所述擬無(wú)枝酸菌工程菌株缺失了擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ku1基因和/或ku2基因，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.權(quán)利要求3所述的擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括以下步驟：

（1）

分別用ku1-U-FOR/ku1-U-REV與ku1-D-FOR/ku1-D-REV和/或ku2-U-FOR/ku2-U-REV與ku2-D-FOR/ku2-D-REV為引物，以擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.)基因組為模板，PCR擴(kuò)增ku1基因和/或ku2基因的上下游同源臂；其中，引物序列為：

ku1-U-FOR ggccagtgccaagcttaggcagagccggtagctcca

ku1-U-REV ctgacacccccttccacatcgatcgcat

ku1-D-FOR ggaagggggtgtcagacatggagtgcc

ku1-D-REV acatgattacgaattcgtcccgctgctgatcgtcgt

ku2-U-FOR ggccagtgccaagcttacgacgaactgcggttccag

ku2-U-REV tttgcgcgctccagatcgctcgcgccat

ku2-D-FOR tctggagcgcgcaaacgcgcttcctga

ku2-D-REV acatgattacgaattctcctgcaggccaccgccaaa

（2）

所得上下游同源臂片段通過(guò)Assembly試劑盒連接到pKC1139質(zhì)粒的HindIII/EcoRI位點(diǎn)，構(gòu)建得到質(zhì)粒pKC1139-ku1和/或pKC1139-ku2；

（3）

利用接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)方法，將pKC1139-ku1和/或pKC1139-ku2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.)中，經(jīng)阿伯拉霉素抗性篩選出陽(yáng)性突變株，獲得敲除ku1和/或ku2基因的擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所得工程菌株經(jīng)PCR驗(yàn)證正確。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟（3）中，所述擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis sp.)是擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis sp.）HM-141，該菌株已于2021年7月9日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 22871。