[發明專利]高效同源重組的擬無枝酸菌工程菌株、其構建方法及應用

有效

• 申請號: 202111116446.7
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113717914B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 孟永宏;強珊;郭建琦;牛永潔;楊璐
• 申請（專利權）人: 陜西海斯夫生物工程有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/31;C12N13/00;C12N15/01;C12P7/24;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

高效同源重組的擬無枝酸菌工程菌株、其構建方法及應用。本發明提供ku1和/或ku2基因缺失在提高擬無枝酸菌(Amycolatopsissp.)的同源重組效率中的應用，本發明還提供高效同源重組的擬無枝酸菌工程菌株，所述擬無枝酸菌工程菌株缺失了擬無枝酸菌的ku1基因和/或ku2基因，本發明還提供所述菌株的構建方法及應用。本發明通過實驗驗證了缺失ku1基因、ku2基因或同時缺失ku1基因和ku2基因均能顯著提高擬無枝酸菌的同源重組效率。其中，ku1基因缺失的工程菌株的同源重組效率達到95％，具有最突出的效果。

【技術領域】

本發明屬于基因工程技術領域。更具體地，本發明涉及一種高效同源重組高效的擬無枝酸菌工程菌株，還涉及所述工程菌株的構建方法及應用。

【背景技術】

香蘭素又稱香草醛(3-甲氧基-4-羥基苯甲醛)，是世界上使用最廣泛的調味料之一，在食品、藥品、化妝品、農業等領域被廣泛應用。香蘭素可由天然底物阿魏酸生物轉化而來，擬無枝酸菌屬被報道能夠利用阿魏酸生產香蘭素，具有非常好的產業化應用價值。但是由于同源同組效率低，使得基因打靶等遺傳操作難度大，限制了香蘭素合成中的代謝工程改造，這可能與擬無枝酸菌的GC含量高、質粒轉化后非同源DNA整合頻率高等有關。因此，開發一種遺傳操作高效的擬無枝酸菌底盤細胞及其方法具有重要的應用價值。

基因打靶技術是現代分子生物學的一個重要研究手段，通常是指利用同源重組的方法將含已知序列的外源DNA片段與生物體基因組發生結合，整合至受體染色體特異性靶位點上。該技術可增加外源DNA片段，或者刪除同源臂之間DNA片段，可以用于基因敲除、基因替換和外源基因定點過表達等多種遺傳改造。因此，基因打靶技術在代謝工程改造研究中發揮著非常重要的作用。在擬無枝酸菌中DNA雙鏈斷裂修復主要依靠非同源末端連接途徑(Non-homologous End Joining，NHEJ)，導致外源DNA主要以隨機插入方式整合至基因組染色體上，同源重組效率低下，嚴重制約了基因打靶技術在擬無枝酸菌中的應用。因此一種高效的基因打靶技術將為擬無枝酸菌菌株基因工程改造提供重要技術支持。

【發明內容】

本發明的目的是通過基因改造提供一種高效同源重組的擬無枝酸菌工程菌株，還提供所述工程菌株的構建方法及應用。

本發明的思路是研究ku1基因或ku2基因與擬無枝酸菌在同源重組實驗的有效率關系，確認ku1基因或ku2基因的敲除在提高擬無枝酸菌的同源重組效率的意義。

基于此，本發明提供ku1基因缺失在提高擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的同源重組效率中的應用。在本發明中，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本發明還提供ku2基因缺失在提高擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的同源重組效率中的應用。所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明還提供高效同源重組的擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株，所述擬無枝酸菌工程菌株缺失了擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的ku1基因和/或ku2基因。

在本發明中，所述ku1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ku2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

進一步地，本發明還包括上述擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)工程菌株的構建方法，所述方法包括以下步驟：

(1)

分別用ku1-U-FOR/ku1-U-REV與ku1-D-FOR/ku1-D-REV和/或ku2-U-FOR與ku2-U-REV為引物，以擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.)基因組為模板，PCR擴增ku1基因或ku2基因的上下游同源臂；

(2)