[發明專利]基于CRISPR/Cas12a技術檢測新冠病毒和69/70突變株的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202111115472.8
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113881806A
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發明（設計）人: 黃黎珍;左青霞;何昌生;莫國圣;杜紅麗;林采玲;萬延斌;黃冬超;陳鋒;馮冬燕;許萬青;孫琪;韓立亞
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

本發明公開一種基于CRISPR/Cas12a技術檢測新冠病毒和69/70突變株的方法及試劑盒。本發明通過LbaCas12a/crRNA系統特異性識別DNA靶標的能力，通過分別設計針對新冠病毒的非突變的靶點69/70和突變靶點69/70缺失的69/70?crRNA?W以及69/70?crRNA?M，對樣品分子進行檢測，只需要一臺PCR儀或者恒溫裝置和簡易熒光讀取裝置，當使用兩個crRNA檢測同一個樣品時，可快速、有效區分核酸樣品中含有新冠病毒野生型還是69/70缺失突變株，同時具有高特異性、高靈敏度以及低成本的特點，更加廣泛適用于各種分子診斷實驗室。本發明對新冠病毒疫情防控具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于快速檢測新冠病毒 (SARS-CoV-2)野生型和突變株(69/70缺失突變)的方法及試劑盒，具體是利用Cas12a/crRNA特異性快速檢測SARS-CoV-2野生型和變異株的69/70缺失突變。

背景技術

SARS-CoV-2突變逐漸增加。在英國發現的B.1.1.7突變株中，有一種69/70 缺失突變，該突變是由新冠病毒(SARS-CoV-2)S蛋白上的69位和70位氨基酸缺失導致，而該缺失可能讓病毒的感染力翻倍從而加劇疫情防控的難度。

新冠病毒檢測方法主要分為核酸檢測法和抗體檢測法，因為靈敏度和特異性的要求，檢測新冠病毒突變主要是通過全基因組測序(WGS)或者Sanger測序的方法進行，但是該檢測方法速度慢且不適合所有分子診斷實驗室。因此開發一種快速的、靈敏的、便捷的、低成本的新冠病毒69/70缺失突變的檢測方法及試劑盒對于本領域疫情防控與治療、新冠突變株的早期發現具有重要意義。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種基于 CRISPR/Cas12a技術快速檢測新冠病毒野生型和突變株的試劑盒。

本發明的另一目的在于提供一種基于CRISPR/Cas12a技術快速檢測新冠病毒野生型和突變株的方法。該方法是一種利用LbaCas12a/crRNA系統進行新冠病毒野生型和69/70缺失突變株的檢測方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種基于CRISPR/Cas12a技術快速檢測新冠病毒野生型和突變株的試劑盒，包括LbaCas12a、針對69/70位點野生型特異性69/70-crRNA-W序列、針對69/70 缺失突變株的特異性69/70-crRNA-M序列、針對新冠病毒野生型和突變株特征序列的RT-RAA引物或RT-PCR引物、報告單鏈DNA分子；

為了更好的實現本發明，所述試劑盒可結合RT-RAA、RT-RPA等恒溫擴增技術或者逆轉錄PCR(RT-PCR)技術進行新冠病毒核酸的逆轉錄以及擴增；

優選的，所述試劑盒還包括A Buffer、NEBuffer2.1、RNase Inhibitor、凍干 RT-RAA反應微球、MgAc。

所述的特異性69/70-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，特異性 69/70-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示，與傳統crRNA設計不同，該序列旁的PAM序列為TTC而不是傳統的TTTV。

所述的針對新冠病毒野生型和突變株特征序列的RT-RAA引物為 69/70-RT-RAA-F/R引物組(SEQ ID NO：3～4)，所述RT-RAA引物是通過新冠病毒高通量序列比對，分析引物候選區域的突變頻率，結合新冠病毒分子流行病學特征及RT-RAA引物需求篩選出來的高效特異序列；

所述的針對新冠病毒野生型和突變株特征序列的RT-PCR引物為 69/70-RT-PCR-F/R引物組(SEQ ID NO：5～6)，所述RT-PCR引物是通過新冠病毒高通量序列比對，分析引物候選區域的突變頻率，結合新冠病毒分子流行病學特征及RT-PCR引物需求篩選出來的高效特異序列；