[發明專利]基于CRISPR/Cas12a技術檢測新冠病毒和69/70突變株的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202111115472.8
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113881806A
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發明（設計）人: 黃黎珍;左青霞;何昌生;莫國圣;杜紅麗;林采玲;萬延斌;黃冬超;陳鋒;馮冬燕;許萬青;孫琪;韓立亞
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

1.一種基于CRISPR/Cas12a技術快速檢測新冠病毒野生型和突變株的試劑盒，其特征在于：包括LbaCas12a、針對69/70位點野生型特異性69/70-crRNA-W序列、針對69/70缺失突變株的特異性69/70-crRNA-M序列、針對新冠病毒野生型和突變株特征序列的RT-RAA引物或RT-PCR引物、報告單鏈DNA分子；

所述的特異性69/70-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，特異性69/70-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的針對新冠病毒野生型和突變株特征序列的RT-RAA引物為SEQ ID NO：3～4所示的69/70-RT-RAA-F/R引物組；

所述的針對新冠病毒野生型和突變株特征序列的RT-PCR引物為SEQ ID NO：5～6所示的69/70-RT-PCR-F/R引物組；

所述的69/70-RT-RAA-F/R引物組用于擴增含有與69/70-crRNA-W和/或69/70-crRNA-M互補的核酸片段；

所述的69/70-RT-PCR-F/R引物組用于擴增含有與69/70-crRNA-W和/或69/70-crRNA-M互補的核酸片段。

2.根據權利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a技術快速檢測新冠病毒野生型和突變株的試劑盒，其特征在于：

所述的報告單鏈DNA分子為SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

3.一種基于CRISPR/Cas12a技術快速檢測新冠病毒野生型和突變株的方法，其特征在于：該方法用于非診斷或治療目的，包括如下步驟：

(1)針對新冠病毒野生株以及突變株的基因組序列，設計野生型非突變69/70和突變株69/70缺失位點特異性的69/70-crRNA-W和69/70-crRNA-M序列，設計的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1～2所示，再構建69/70-crRNA-W和69/70-crRNA-M體外轉錄載體并進行體外轉錄和純化，或者直接合成；

(2)針對步驟(1)所述的新冠病毒的非突變69/70及突變靶點69/70缺失設計RT-RAA引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：3～4所示，對待測核酸樣品進行RT-RAA反應，獲得RT-RAA反應產物；或者，針對步驟(1)所述的新冠病毒的非突變69/70以及突變靶點69/70缺失設計RT-PCR引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：5～6所示，對待測核酸樣品進行RT-PCR反應，獲得RT-PCR反應產物；

(3)將步驟(1)所述的純化后的crRNA體外轉錄產物或合成的69/70-crRNA-W或69/70-crRNA-M分子、步驟(2)所述RT-RAA或者RT-PCR反應產物、LbaCas12a、報告單鏈DNA分子以適當比例混合于適當體系中進行反應；

(4)反應產物通過熒光或側流免疫層析試紙檢測獲得檢測結果。

4.根據權利要求3所述的基于CRISPR/Cas12a技術快速檢測新冠病毒野生型和突變株的方法，其特征在于：

步驟(3)中的報告單鏈DNA分子設計：用于側流免疫層析試紙檢測時，兩端分別帶有Digoxin和Biotin基團的12堿基隨機序列單鏈DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′，見SEQ ID NO：7；

用于熒光檢測時，兩端分別帶有FAM和BHQ1基團的12堿基隨機序列單鏈DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′，見SEQ ID NO：8。